高血压作为最常见的慢性疾病,已成为世界范围内重要的公共卫生问题,早期发现、预防和控制高血压的发生发展已成为降低心脑血管疾病发病和死亡的重要手段。随着我国人口老龄化的发展,高血压问题日渐严峻,呈现患病率高,知晓率、治疗率和控制率低的形势。长春市由于特殊的地理位置,高血压的流行病学状况具有其自身的特点,全面了解现阶段长春市老年人群高血压的患病、知晓、治疗和控制现状,有助于当地政府科学地制定针对性的卫生政策,缓解目前高血压的严峻形势,降低疾病负担。高血压的发病机制十分复杂,受到多种因素的调控,其中内皮功能障碍是被广泛认可的高血压发病机制之一。内皮细胞功能障碍可能导致血管活性因子异常释放,血管重构和微血管稀疏化,使血管收缩能力增强,外周循环阻力增加,进而导致高血压的发生。近年来,miRNA被发现可通过影响内皮细胞功能在高血压中发挥作用。课题组前期研究发现miR-3656在高血压人群中高表达,可能参与高血压的发生,已知在miRNA的复杂调控网络中,同一miRNA可通过靶向不同的基因调控不同的通路参与到疾病的发生发展中,那么,进一步寻找与转录调控相关的miR-3656的下游基因,探索miR-3656和转录因子在内皮细胞功能障碍中的作用,有助于为高血压的发病提供新的分子机制。目的:本研究共分为两部分,第一部分拟通过对长春市60岁以上老年人群的现况调查,分析该部分人群高血压患病、知晓、治疗和控制情况及其影响因素,为更全面地了解该地区高血压现状提供数据支持。第二部分拟基于课题组前期研究成果,进一步探究miR-3656及其下游转录调控基因在内皮细胞功能障碍中的作用机制,并在人群水平检测miR-3656和下游基因的表达以及与临床指标间的关系,探究miR-3656和下游基因作为高血压生物标志物的潜在价值,为高血压的发病机制及临床治疗提供科学依据。方法:在第一部分中,采用单纯随机抽样的方法,纳入6846名长春市60岁以上常住居民。收集研究对象的一般人口学特征(性别、年龄、民族、婚姻状况、教育水平、职业和年收入)、生活行为方式(吸烟、饮酒和体育锻炼)、疾病史(高血压、糖尿病、血脂异常、冠心病和脑卒中)、家族史和用药史等基本信息。对研究对象进行体格检查(身高、体重和血压)和实验室检查(空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇)。分析研究对象基本特征和高血压患病、知晓、治疗和控制情况,多因素logistic回归分析高血压相关危险因素以及与高血压知晓、治疗和控制相关的独立影响因素。在第二部分中,首先通过MTS实验、划痕实验、流式细胞术和成管实验分别检测miR-3656对内皮细胞HUVEC和HAEC增殖、迁移、凋亡和管腔形成等功能的影响;通过转录组测序检测miR-3656高表达对内皮细胞转录组的影响,进行基因表达差异分析和富集分析;之后结合转录组数据和预测网站筛选miR-3656的靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验、RT-q PCR和Western blot检测miR-3656对靶基因TFAP2C的调控关系;通过生物信息学网站JASPAR、ENCODE、h TFtarget和GTRD对转录因子TFAP2C的靶基因进行预测,通过Ch IP-q PCR、RT-q PCR和Western blot检测TFAP2C与靶基因KLF10的调控关系;通过MTS实验、划痕实验、流式细胞术和成管实验分别检测TFAP2C和KLF10对HUVEC和HAEC细胞功能的影响;通过营救实验,即分别共转染miR-3656mimic和TFAP2C过表达质粒,共转染si-TFAP2C和KLF10过表达质粒,共转染miR-3656 mimic和KLF10过表达质粒后对内皮细胞功能的影响,研究miR-3656/TFAP2C/KLF10轴Hepatosplenic T-cell lymphoma在内皮细胞功能障碍中发挥的作用;最后,通过RT-q PCR和ELISA检测91名高血压患者和101名健康对照血浆中miR-3656、TFAP2C和KLF10的表达水平,分析三者与临床指标间的相关性。结果:第一部分:2019年长春市老年人群高血压患病率为52.6%,超重(OR=1.599,95%CI:1.432–1.785)或肥胖(OR=2.411,95%CI:2.067–2.813)、糖尿病(OR=1.501,95%CI:1.347–1.672)和高血压家族史(OR=4.226,95%CI:3.439–5.195)是高血压的危险因素。高血压的知晓率为87.6%,超重(OR=1.260,95%CI:1.006–1.579)或肥胖(OR=1.383,95%CI:1.031–1.856)、经常锻炼(OR=1.336,95%CI:1.048–1.703)、患有冠心病(OR=1.618,95%CI:1.137–2.300)或有高血压家族史(OR=2.280,95%CI:1.576–3.300)的人群更容易意识到自己的高血压情况。高血压的治疗率为69.1%,女性(OR=1.187,95%CI:1.027–1.372)、超重(OR=1.367,95%CI:1.162–1.608)或肥胖(OR=1.604,95%CI:1.303–1.976)、经常体育锻炼(OR=1.420,95%CI:1.192–1.690)或有高血压家族史(OR=1.315,95%CI:1.061–1.629)的人群更有可能治疗高血压。在服用降压药的高血压患者中,7.4%的人群使用联合药物治疗策略。高血压的控制率为66.9%,服用降压药(OR=4.441,95%CI:3.803–5.186)的人群更可能将血压控制在正常范围内。第二部分:1.miR-3656对内皮细胞生物学功能和转录组的影响与NC组相比,miR-3656 mimic组细胞增殖、迁移和成管能力受到抑制,凋亡能力升高(P<0.05);miR-3656 inhibitor组细胞增殖、迁移和成管能力升高,凋亡能力降低(P<0.05)。转录组测序共筛选出差异表达的基因1736个,其中上调的基因1000个、下调的基因736个。GO分析表明这些差异表达的基因主要参与的生物过程有细胞代谢、氮化物代谢等,参与的细胞组成有膜结构细胞器、隔膜封闭式内腔等,参与的分子功能有细胞粘附分子结合、钙粘蛋白结合等。KEGG分析表明这些基因主要参与粘着斑、细胞衰老、TNF信号通路、流体剪切应力和线粒体自噬等通路。2.miR-3656靶基因的筛选与验证结合转录组测序结果和网站预测结果筛选出TFAP2C可能为miR-3656的靶基因。双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-3656与TFAP2C 3'UTR端靶向结合。RT-q PCR与Western blot结果表明,与NC组相比,miR-3656 mimic组TFAP2C的m RNA和蛋白表达水平明显降低,miR-3656 inhibitor组TFAP2C的m RNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。3.转录因子TFAP2C靶基因的筛选与验证结合生物信息学网站和转录组测序结果筛选出KLF10可能为TFAP2C的靶基因。Ch IP-q PCR实验结果表明TFAP2C与KLF10启动子区结合。RT-q PCRLY294002分子式和Western blot结果表明,与NC组相比,si-TFAP2C组KLF10的m RNA和蛋白表达水平明显降低,Ad-TFAP2C组KLF10的m RNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。转染miR-3656 mimic或miR-3656 inhibitor后,与NC组相比,miR-3656mimic组KLF10的表达水平明显降低,miR-3656 inhibitor组KLF10的表达水平明显升高(P<0.05)。共转染miR-3656 mimic和TFAP2C过表达质粒后,KLF10的表达量无明显变化,说明miR-3656通过TFAP2C调控KLF10的表达。4.TFAP2C和KLF10对内皮细胞功能的影响与NC组相比,si-TFAP2C组和si-KLF10组内皮细胞的增殖、迁移和成管能力受到抑制,凋亡能力升高(P<0.05);Ad-TFAP2C组和Ad-KLF10组内皮细胞的增殖、迁移和成管能力升高,凋亡能力降低(P<0.05)。5.miR-3656/TFAP2C/KLF10轴介导内皮细胞功能障碍共转染miR-3656 mimic和TFAP2C过表达质粒后,与miR-3656 mimic组相比,miR-3656 mimic+Ad-TFAP2C组内皮细胞的增殖、迁移和成管能力增高,凋亡能力降低(P<0.05),说明TFAP2C可以逆转miR-3656对内皮细胞的损伤作用。共转染si-TFAP2C和KLF10过表达质粒后,与si-TFAP2C组相比,si-TFAP2C+Ad-KLF10组内皮细胞的增殖、迁移和成管能力增高,凋亡能力降低(P<0.05),说明KLF10可以逆转沉默TFAP2C对内皮细胞的损伤。共转染miR-3656 mimic和KLF10过表达质粒后,与miR-3656 mimic组相比,miR-3656mimic+Ad-KLF10组内皮细胞的增殖、迁移和成管能力增高,凋亡能力降低(P<0.05),说明KLF10可以逆转miR-3656对内皮细胞的损伤作用。以上结果表明miR-3656/TFAP2C/KLF10轴在内皮细胞功能障碍中发挥调控作用。6.miR-3656、TFAP2C和KLF10在高血压人群血浆中的表达miR-3656在高血压患者血浆中高表达,且随高血压等级的升高表达量增加(P<0.05)。TFAP2C在高血压患者血浆中低表达(P<0.05),KLF10在两组人群中表达没有差异。相关性分析结果表明,miR-3656与TFAP2C表达量负相关,与KLF10表达量无关;TFAP2C与KLF10表达量正相关;miR-3656表达量与收缩压、舒张压和甘油三酯正相关;TFAP2C表达量与收缩压和舒张压负相关;KLF10表达量与低密度脂蛋白胆固醇负相关。结论:1.2019年长春市老年人群高血压患病率高于全国平均水平;高血压知晓率、治疗率和控制率相较于全国均处于较高水平。男性、丧偶、不经常锻炼、患有糖尿病、血脂异常、有高血压家族史的人群应作为高血压防控工作的重点人群。2.miR-3656过表达诱导血管内皮细胞功能障碍,TFAP2C和KLF10则是血管内皮功能的保护因子。3.miR-3656靶向TFAP2C的3'UTR端负向调控TFAP2C的表达,MCC950TFAP2C与KLF10的启动子区结合正向调控KLF10的表达,miR-3656过表达通过调控TFAP2C/KLF10轴参与血管内皮细胞功能障碍。4.miR-3656在高血压患者中高表达且与高血压的发展和严重程度相关,TFAP2C在高血压患者中低表达,二者可作为高血压的潜在生物标志物。