阿尔茨海默症(AD)是一种神经退行性疾病,目前已有多种生物标志物被发现,其中tau蛋白是阿尔茨海默症重要生物标志物之一。tau蛋白异常磷酸化是AD的重要疾病特征,由于没有有效的治病药物,所以只能通过早发现,早预防的方式减少危重症患者,早发现则需要较为准确的检测方法,以免漏诊或误诊,因此建立一种针对tau蛋白的高准确度检测方法非常重要。本研究以纯化重组的全长tau蛋白(441)为研究对象,在试验前将tau蛋白分装成100μg/m L,样品存放于-80℃的冰柜中,通过同一批样品来探究准确定量tau蛋白的可靠方法。探究不同标的物对检测结果和检测方法的影响,并验证不同方法的一致性。实验方法和结果如下:以In Vitro Transcription Kits纯化重组的全长有441个氨基酸序列的tau蛋白为研究对象,以酶解得到的稳定特征肽段作为检测目标物,实现了对tau蛋白的定值。对酶解实验中胰蛋白酶的添加量和酶解时间优化后得到酶添加量应与蛋白质比Bucladesine生产商例为1:10,酶解时间应≥48 h。在酶解前引入标记的特征肽段共同参与酶解,检测标记与普通肽段的峰面积比值。计算可得到tau蛋白溶液的准确浓度,并多次实验检测方法和肽段的稳定性。最后实现了对简单基体中tau蛋白的定值,定值结果为75.08±3.00μg/m L。以氨基酸水解法将tau蛋白充分水解成氨基酸,通过对目标氨基酸的检测实现了对tau蛋白的定值分析。在氨基酸水解实验中,分别对温度、盐酸浓度、盐酸加入量和水解时长进行优化,最终选用130℃,加入1.2m L的6 mol/L盐酸水解48小时得到水解样品。水解前加入理论质量比约为1:1的标记氨基酸,实验选了五种氨基酸分别是缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸,水解后在LC-MS质谱仪中分别检测对应氨基酸的普通和加标氨基酸的峰面积比值,带入公式可求得tau蛋白的准确浓度。经过多次实验得到tau蛋白的定值结果为74.47±3.00μg/m L。采用高效液相色谱与高分辨电感耦合等离子体质谱仪联用,将色谱的分离优势与质谱的检测优势结合,通过对tau蛋白中的硫元素的检测定值实现了对tau蛋白的检测定值。实验使用岛津高效液相色谱仪自带的副泵以0.15 m L/min的流速将0.1 ppm的~(34)S同位素稀释剂稳定的泵入三通混合管中,与样品所在管路混合后进入高分辨ICP-MS,通过对~(32)S和~(34)S的信号响应强度的检测得到蛋白质的质谱峰,依据质量流公式计算后可得到待测样品中天然硫的准确浓度,经由硫元selleck化学素与tau蛋白在质量上的对应关系得到tau蛋白的准确浓度。经过多次实验得到tau蛋白的定值结果为74.13±3.00μg/m L。上述三种实验方法的定值结果较为一致,在多次试验后仍结果稳定,同时证明了方法和样品的稳定性,构成了可用于简单基体中tau蛋白高准确度定量分析的实验方法。