目的糖尿病肾病是糖尿病的严重微血管并发症之一,被认为是终末期肾病的主要原因,其致死致残率高,目前对糖尿病肾病的发病机制仍不清楚。研究显示,在糖尿病肾病的发病过程中,铁死亡可能作为一种新型细胞死亡方式参与其发病过程。阿托伐他汀(Atorvastain,AT)是3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶抑制剂。在临床上除了具有降脂和抗炎的作用,还具有非依赖降脂的肾脏保护效应。AT是否通过调节铁死亡途径来提供保护尚不清楚。本课题将探讨AT对糖尿病肾病的保护作用,探讨其可能机制是否与铁死亡相关。方法1.体内实验选取C57BL/6J小鼠,雄性6周龄18只,体重为24-30 g,SPF级,购于辽宁长生生物有限公司,随机分为两组:正常对照组(Con组,n=6),喂普通饲料,自由饮水;糖尿病组,喂高脂饲料(含45%脂肪、20%蛋白质和35%碳水化合物),联合链脲佐菌素(STZ,55 mg/kg)连续5天腹腔注射,建立2型糖尿病模型。造模3天后,采用尾静脉采血的方法进行空腹血糖的测定,造模成功的指标为血糖≥11.1 mmol/L。小鼠造模成功后,随机分为两组,一组是模型组(STZ组,n=6),另一组是阿托伐他汀治疗组(AT组,n=6),治疗组小鼠每日每只灌胃阿托伐他汀钙(45 mg/kg/d),每周称量小鼠体重、测定小鼠血糖,连续灌胃8周,取材,检测尿液和血清。取肾脏进行组织学切片,行HE、PAS染色观察其病理变化,进行DHE染色检测肾脏中活性氧的含量。采用免疫组化法检测MDA、4-HNE在肾脏的含量;应用Western Blot法测定铁死亡相关蛋白Nrf_2、GPX_4、TFR、FTH,肾脏纤维化相关蛋白Fibronectin和TGFβ,ROS相关蛋白p22phox和gp91phox的表达情况。2.体外实验低糖DMEM体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞),分别采用高糖(30 mmol/L,HG组)和Erastin(10μmol/L,铁死亡诱导剂,Er组)作用HK-2细胞24h,通过DCFH-DA荧光染色法测定HK-2细胞氧化荧光强度,采用Western blot测定铁死亡相关蛋白的变化。实验结果本研究包括体内和体外实验二部分体内实验结果如下:1.与Con组相比,STZ组小鼠体重明显下降,AT干预后体重升高。血糖结果显示,腹腔注射STZ后小鼠随机血糖明显升高,STZ组、AT组小鼠血糖均高于同期Con组水平,治疗后,与STZ组对比,AT组小鼠血糖轻度下降,但无统计学差异。2.与Con组相比,STZ组小鼠TG、TC、尿蛋白与肌酐比值均显著升高,AT干预后TG、TC尿蛋白与肌酐比值均明显降低。3.组织学切片结果表明,AT显著改善糖尿病肾病引起的肾小球肥大,肾小管空泡、糖原沉积、肾脏纤维化和活性氧含量。4.Western blot结果显示:与Con组相比,铁死亡相关蛋白FTH、Nrf_2与GPX_4在STZ组小鼠肾组织表达降低,TFR表达增加,纤维化相关蛋白Fibronectin、TGFβ蛋白表达增加,NADPH氧化酶亚基p22phox、gp91phox蛋白表达增加,AT干预后FTH、GPX_4和Nrf_2蛋白表达增加,TFR、Fibronectin、TGFβ蛋白表达降低,NADPH氧化酶亚基p22phox和gp91phox蛋白表达下降。5.免疫组化结果显示:STZ组小鼠肾组织中脂质氧化标示物MDA、4-HNE的表达明显高于Con组,AT干预后MDA、4-HNE的含量均明显降低。体外实验结果:1.高糖诱导的Hselleck化学K-2细胞ROS染色显示,高糖诱导HK-2细胞后,细胞的活性氧含量增加,经AT干预后活性氧含量下降。Western blot结果表明与NG组相比,HG组细胞的MDA和4-HNE的蛋白表达升高,经AT干预后,MDA和4-HNE的蛋白表达减少。2.高糖诱导的铁死亡相关蛋白的Western blot结果显示,高糖诱导HK-2细胞后,细胞内FTH、Nrf_2、GPX_4表达下降,TFR表达增加,AT干预可以增加FTH、GPX_4、Nrf_2蛋白表达,降低TFR蛋白表达。3.Erastin诱导的HK-2细胞ROS染色显示,Erastin诱导HK-2细胞后,细胞的ROS含量增加,经AT干预后ROS含量下降。Western blot显示与NG组比较,MDA与4-HNE的表达在Er组中升高,经ATGSI-IX干预Embryo biopsy后,可以逆转其表达。4.Erastin诱导的铁死亡相关蛋白的Western blot结果显示,Erastin诱导HK-2细胞后,细胞内FTH、Nrf_2、GPX_4表达下降,TFR表达增加,AT干预后可以改善相关蛋白的表达情况。5.Erastin诱导的HK-2细胞Fe2+荧光染色显示,与NG组相比,Er组细胞的平均荧光强度增强,经AT干预后,平均荧光强度减少。结论1.阿托伐他汀可以降低STZ诱导的糖尿病肾病小鼠肾功能损害、降低血脂,改善肾脏功能及病理结构损害。2.阿托伐他汀可以明显地降低糖尿病肾病小鼠的肾组织氧化应激,上调Nrf_2通路并抑制肾脏铁死亡。在体外HK-2细胞,阿托伐他汀可以抑制高糖或铁死亡诱导剂Erastin引起的肾细胞铁死亡来保护HK-2。3.阿托伐他汀可以改善糖尿病肾病小鼠肾功能和肾组织结构损伤,其机制可能与降低肾脏细胞的氧化应激和肾细胞铁死亡有关。