研究背景随着我国人群饮食结构和生活方式等发生改变,2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者数量逐年增多且年轻化趋势明显。糖尿病性骨质疏松症(Diabetic osteoporosis,DOP)是T2DM常见并发症,患者表现为骨矿物质密度(BBrain biopsyone mineral density,BMD)降低、骨质量下降、骨脆性增加、骨折风险升高,生存质量和生存时间均受到显著影响。因此针对T2DM患者探索有效的骨保护措施具有重要意义。胰岛素样生长因子-1(Insulin like 确认细节growth factor-1,IGF-1)是骨骼中最丰富、最关键的生长因子,以旁分泌、自分泌和内分泌等形式调控骨骼生长。IGF-1与成骨细胞膜IGF-1受体(IGF-1 receptor,IGF-1R)结合后,能够激活磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide3-Kinase,PI3K)/蛋白激酶-B(Protein kinase B,AKT)通路并调节下游细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-Associated X,Bax)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)等多个细胞增殖、凋亡、分化相关基因表达,从而调节骨骼代谢、促进骨骼生长、维持骨健康。T2DM患者IGF-1的生成和释放显著减少,循环和局部骨组织中IGF-1水平降低,导致成骨细胞的生成、活性及功能受到严重影响,致使骨流失增多、骨形成减少、骨质量降低。钙、磷、1,25-二羟基维生素D3(1,25 Dihydroxy Vitamin D3,1,25-(OH)_2D_3)是骨骼三大营养素,而肾脏是调节机体钙、磷代谢以及生成1,25-(OH)_2D_3的主要器官,因此肾功能对骨健康具有重要影响。T2DM可导致机体肾功能降低,引发钙、磷代谢紊乱、1,25-(OH)_2D_3生成减少,推动DOP进展。大豆异黄酮(Soybean isoflavones,SI)属于天然植物雌激素,能够模拟雌激素效应,具有抗绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)、肾脏保护、抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤等多种生物学功能。雌马酚(Equol,Eq)是SIselleck合成在体内代谢的主要终产物之一和发挥健康效应的主要介质。Eq的分子结构与雌二醇接近,结构稳定性和雌激素受体亲和力均较SI更高,类雌激素效应较SI更强,并且相比于雌激素无明显副作用,然而仅30%～40%成年人群能够将食物中的SI代谢为Eq。研究发现雌激素以及SI可促进IGF-1基因表达,发挥骨保护效应,但Eq对DOP的效应及机制尚不明确。因此本课题建立T2DM大鼠模型并开展细胞实验,针对Eq对T2DM大鼠的骨保护效应及机制进行探索,为DOP的防治工作提供实验依据。目的本研究旨在探讨Eq对DOP的防治效应及机制,为DOP的防治工作提供新的思路。研究方法1.采用高糖高脂饮食诱导联合链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射建立T2DM大鼠模型,将大鼠分为对照组、模型组、低剂量Eq组(Eq L组,20mg/kg·d)、中剂量Eq组(Eq M组,40mg/kg·d)、高剂量Eq组(Eq H组,80mg/kg·d),Eq或玉米油连续灌胃干预12周。2.12周后,双能X线骨密度仪检测大鼠股骨、躯干BMD,苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、显微CT(Micro-CT)观察股骨干骺端微结构、检测骨小梁指标,ELISA试剂盒检测血清骨代谢标志物、1,25-(OH)_2D_3水平,生化分析仪检测血清钙、磷水平,Western blot和Real-Time PCR(RT-PCR)检测股骨干骺端组织IGF-1等基因表达水平及IGF-1R、PI3K/AKT通路磷酸化水平;生化试剂盒检测大鼠血清尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,CREA)、尿酸(Uric acid,UA)水平,HE染色和过碘酸雪夫(Periodic acid-schiff,PAS)染色观察肾组织微结构。3.采用高浓度葡萄糖联合棕榈酸钠建立ROS17/2.8成骨细胞高糖高脂损伤模型,实验分为对照组(C组)、模型组(M组)、Eq~(-7)组(10~(-7)mol/L Eq)、Eq~(-6)组(10~(-6)mol/L Eq)、Eq~(-5)组(10~(-5)mol/L Eq)。Eq或溶剂对照干预24h后,采用细胞增殖检测试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK8)检测细胞活力,HE染色观察细胞形态,流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布,Western blot和RT-PCR检测细胞IGF-1等基因表达水平及IGF-1R、PI3K/AKT通路磷酸化水平;分别联合应用IGF-1R抑制剂(NVP-ADW742)、PI3K抑制剂(LY294002),验证IGF-1及PI3K/AKT通路在Eq对高糖高脂环境下成骨细胞保护效应中的作用。结果1.Eq干预T2DM大鼠12周后:与对照组比,模型组大鼠股骨、躯干BMD以及股骨干骺端骨小梁数量(Trabecular number,Tb.N)、骨体积/组织体积(Bone volume/Tissue volume,BV/TV)、骨表面密度(骨表面积/组织体积,Bone surfac/Tissue volume,BS/TV)均显著降低,骨小梁分离度(Trabecular separation,Tb.Sp)显著增加,骨微结构明显损伤,血清骨形成标志物骨特异性碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,BALP)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(Propeptide of type I procollagen,PINP)水平显著降低,骨吸收标志物吡啶啉(Pyridine,PYD)、Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(Ridinoline cross-linked N-telopeptides of type 1 collagen,NTX)、核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)水平显著升高,股骨干骺端IGF-1、Bcl-2、Cyclin D1基因表达水平显著降低,Bax基因表达水平显著增强,IGF-1R、PI3K/AKT通路磷酸化水平显著降低(均P<0.05);与模型组比,各Eq干预组大鼠股骨、躯干BMD以及股骨干骺端Tb.N、BV/TV、BS/TV均显著增加,Tb.Sp显著降低,骨微结构显著改善,血清BALP、PINP水平显著升高,PYD、NTX、RANKL水平显著降低,股骨干骺端IGF-1、Bcl-2、Cyclin D1基因表达水平显著增强,Bax基因表达水平显著降低,IGF-1R、PI3K/AKT通路磷酸化水平显著升高(均P<0.05);各Eq干预组组间相比各指标均无统计学差异。2.Eq干预T2DM大鼠12周后:与对照组比,模型组大鼠血清磷、BUN、CREA、UA水平显著升高,血清1,25-(OH)_2D_3水平显著降低(均P<0.05),肾组织微结构明显损伤;与模型组比,各Eq干预组大鼠血清磷、BUN、CREA、UA水平显著降低,血清1,25-(OH)_2D_3水平显著升高(均P<0.05),肾组织微结构损伤显著减轻;各Eq干预组组间相比各指标无统计学差异。3.Eq干预ROS17/2.8成骨细胞24h后:与C组比,M组细胞存活率显著降低、细胞抑制率显著增加,细胞形态结构明显损伤,细胞凋亡率显著增加,细胞周期G_1期比例显著增加、S期比例显著降低,IGF-1、Bcl-2、Cyclin D1基因表达水平显著降低,Bax基因表达水平显著增强,IGF-1R、PI3K/AKT通路磷酸化水平显著降低(均P<0.05);与M组比,各Eq干预组细胞存活率显著升高、细胞抑制率显著降低,细胞形态结构损伤明显减轻,细胞凋亡率显著减少,细胞周期G_1期比例显著降低、S期比例显著增加,IGF-1、Bcl-2、Cyclin D1基因表达水平显著增强,Bax基因表达水平显著降低,IGF-1R、PI3K/AKT通路磷酸化水平显著升高(均P<0.05),且Eq的干预效应具有浓度趋势;联合应用NVP-ADW742或LY294002后,Eq对高糖高脂环境下ROS17/2.8成骨细胞活力、凋亡、细胞周期分布及基因表达的调控效应显著降低。结论1.Eq能够调节T2DM大鼠骨代谢、减轻骨微结构损伤,提高股骨、躯干BMD,发挥骨保护效应,其机制可能与Eq促进骨组织IGF-1基因表达、激活PI3K/AKT通路相关。2.Eq能够减轻T2DM大鼠肾组织微结构损伤、改善肾功能,降低血清磷水平、促进1,25-(OH)_2D_3的生成,间接发挥骨保护效应。3.Eq通过促进IGF-1基因表达、激活PI3K/AKT通路提高高糖高脂环境下ROS17/2.8成骨细胞活性,减轻细胞形态损伤,减少细胞凋亡,推动细胞周期进展。