非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)引起的高传染性病毒性疾病。自2018年我国出现首例ASF以来,其在大陆各省份迅速蔓延。研究表明ASFV感染后的临床症状类型广泛,极易诱发急性出血热,使得患病家猪和野猪可在短时间内从亚临床病症发展至死亡。然而,至今仍未研发出有效治疗预防该病的药物或疫苗,且随着病毒不断地传播与演化,疫病的流行病学状况愈发恶劣,严重影响了我国生猪养殖业的发展。临床上患病猪呈现出不同程度的病征,这与ASFV的致病能力同易感动物免疫系统间的关系密不可分。然而,目前对涉及此部分的相关免疫逃逸机制知识仍然匮乏。I型干扰素(Type I interferon,IFN-I)是病毒感染早期阶段中机体产生的能够快速有效抗病毒的细胞因子之一,而ASFV作为一种具有高度复杂结构的大型双链DNA病毒,拥有着庞大的基因组,这为其进化出更多拮抗IFN-I产生并消除其影响的逃逸通道提供了先天条件。构成ASFV内核芯壳重要组分的pS273R蛋白,是由S273R基因编码的一种半胱氨酸蛋白酶,能切割内核芯壳蛋白前体生成成熟的内核芯壳蛋白,从而参与病毒粒子的组装,在病毒增殖过程中扮演重要角色。截至目前其在宿主免疫反应中的调节作用尚未完全解析。因此,本论文对ASFV pS273R在调控IFN-I信号通路中的作用及作用机制展开了深入研究。1.ASFV pS273R拮抗IFN-I产生的机制首先利用双荧光素酶报告系统发现pS273R蛋白酶在猪源PK-15细胞中对双链DNA模拟物polselleck化学y(d A:d T)诱导IFN-β的荧光活性具有抑制作用,且呈剂量依赖性,推测pS273R可能靶向切割IFN-I通路的关键效应分子。为了筛选可能的作用靶点,将ASFV pS273R与本实验室构建的8个猪源信号分子真核表达质粒分association studies in genetics别共转染至HEK-293T细胞,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)实验结果显示,pS273R蛋白酶呈剂量依赖性地切割DNA模式识别受体DEx H-box解旋酶9(DHX9,DEx H-box helicase 9)蛋白,且直接依赖于其蛋白酶活性。DHX9蛋白在宿主的先天免疫系统中发挥多种功能,本质上属于DEx H-box类RNA解旋酶,有研究报道DHX9具备识别双链DNA的能力,其结构域包括有位于N端的解旋酶核心域(helicase)、C端重复的精氨酸-甘氨酸-甘氨酸域(RGG-Domain)等。本研究通过构建一系列多点突变和截短突变的DHX9真核表达质粒,进一步证实pS273R蛋白酶可多点切割DHX9蛋白,作用区域是位于DHX9蛋白C末端的RGG-Domain,最后通过双荧光素酶实验表明,与全长DHX9蛋白相比,被切割后的产物能够抑制IFN-β的产生,上述研究结果揭示了ASFV pS273R蛋白酶可以作用于DHX9并阻断其介导产生IFN-I的信号通路。2.ASFV pS273R拮抗IFN-I信号转导的机制在证实ASFV pS273R抑制IFN-I产生的基础上,为进一步探究其是否可拮抗IFN-I激活ISGs的产生从而干扰宿主抗病毒状态的建立。通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR)进一步验证,结果显示pS273R蛋白酶可以剂量依赖性降低IFN-α激活干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)的m RNA转录水平,相较于野生型pS273R,丧失了蛋白酶活性的pS273RC232A蛋白对IFN-α激活的抑制效果有所减弱,表明pS273R的蛋白酶活性参与其拮抗IFN-I信号转导。在深入探究其作用机制的过程中,通过Western blot筛选靶蛋白,结果发现pS273R对TYK2蛋白具有特异性切割作用并依赖其蛋白酶活性,此外pS273R还可降解STAT2蛋白,WB试验的灰度分析结果表明,pS273R的蛋白酶活性同样参与调控对STAT2的降解作用。在鉴定TYK2切割位点的试验中,证实pS273R可识别两处连续的P1位点,分别是610与611位的甘氨酸(Glycine,G)残基,且均位于TYK2的假激酶结构域中。与全长TYK2相比,TYK2被切割后的N端产物TYK2-(1-610aa)诱导ISRE启动子活性的能力明显selleck抑制剂减弱,然而C端产物TYK2-(612-1185aa)无明显变化,提示TYK2并非效应靶点。综合以上试验结果表明,ASFV pS273R蛋白酶可通过下调STAT2的表达来负调控IFN-I信号转导通路。综上我们的研究结果表明,ASFV pS273R蛋白酶通过靶向DHX9的RGGDomain进行多点切割,抑制I型IFN的产生;同时,pS273R还能通过降解STAT2蛋白来抑制IFN-I的信号转导;此外,pS273R的蛋白酶活性对抑制IFN-I的产生及信号转导至关重要,揭示了ASFV免疫抑制的一种新策略。