替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)作为治疗胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)一线的化疗药物,可以通过诱导DNA分子鸟嘌呤O~6位置甲基化修饰(O6-methylguanine,O~6-met G)导致DNA链断裂,进而肿瘤细胞死亡。然而,GBM细胞通过多种机制产生对TMZ的抗性,包括O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MMycobacterium infectionGMT)的活性和参与DNA链断裂损伤修复因子的表达水平。值得注意的是,接受TMZ标准疗程的GBM患者中位生存期仅为12-15个月。因此,探索更有效的药物和改善现有的治疗方式对GBM患者至关重要。课题组前期报道了一个新的lncRNA PRADX,通过与多梳抑制复合体2(Polycomb repressive complex 2,PRC2)相互作用,参与调控GBM的发生与进展。我们通过计算机辅助药物设计获得小分子抑制剂EPIC-0307,该化合物通过阻断PRADX与EZH2的结合,显著抑制肿瘤细胞生长。此外,EPIC-0307还能增加TMZ对GBM治疗的敏感性。EPIC-0307可能成为一种潜在的治疗药物,为GBM患者提供新的治疗选择。研究方法:(1)利用计算机模拟构建PRADX与EZH2复合物结构,选择关键位点,在小分selleck抑制剂子化合物数据库中进行筛选潜在抑制剂,进行细胞毒性、药代动力学和安全性评估。(2)选定EPIC-0307作为潜在抑制PRADX-EZH2互作的小分子抑制剂。通过RIP和Ch IRP实验验证其阻断PRADX与EZH2结合,用Co-IP确认其对PRC2复合物的影响;通过Ch IP、q PCR、Western Blot等研究EPIC-0307抑制肿瘤的机制;通过流式细胞术、免疫荧光等验证其对GBM细胞周期阻滞和凋亡的影响。(3)在MGMT阴性GBM中,研究EPIC-0307与TMZ联合治疗效果,通过细胞活力的测定、平板克隆等体外实验,验证EPIC-0307是否提高TMZ敏感性;通过体内外实验确认其是否通过抑制DNA损伤修复来增加TMZ治疗敏感性;在干细胞和分化细胞中验证EPIC-0307的抗肿瘤活性和提高TMZ敏感性。(4)在MGMT阳性GBM中,体外检测EPIC-0307是否增加TMZ治疗敏感性;通过q PCR、Western Blot等实验研究EPIC-0307对DNA损伤修复、ATF3、STAT3通路和MGMT水平的影响;通过外源表达MGMT探究MGMT在EPIC-0307增敏TMZ过程中的作用;构建ATF3低表达的GBM细胞系,通过Co-IP、PLA、Ch IP、O6-met G免疫荧光等方法,研究EPIC-0307如何通过ATF3-p-STAT3-HDAC1表观调控MGMT的表达;最后,在MGMT阳性GBM肿瘤体内验证EPIC-0307对TMZ治疗敏感性的影响。研究结果:(1)PRADX在其340-440n范围内形成“U”型结构与EZH2稳定结合。通过高通量的筛选和细胞毒性研究,得到小分子化合物EPIC-0307,对GBM细胞表现出一定抗肿瘤活性,对正常细胞相对不敏感。EPIC-0307可口服吸收入血,分布于肿瘤组织中。(2)EPIC-0307不影响PRADX和PRC2核心成员的表达,也不影响PRC2的组装,但特异性阻断PRADX和EZH2的结合。导致下游靶点P21和PUMA的H3K27me3富集减少,促进其转录,引起细胞周期阻滞和凋亡。EPIC-0307还在上调P21、抑制细胞周期蛋白的同时抑制Rb信号通路,降低E2F1的表达。(3)EPIC-0307抑制DNA修复基因CHK1、CHK2、RAD50、RAD51和MRE11的转录水平。在MGMT阴性GBM中,EPIC-0307通过逆转TMZ诱导的DNA损伤修复,增加TMZ的敏感性,表现出抗肿瘤活性。这一发现在GBM干细胞和对应的分化细胞中得到验证。(4)在MGMT阳性GBM中,EPIC-0307通过调节DNA损伤修复、降低MGMT的表达,增加TMZ的敏感性。EPIC-0307上调ATF3,抑制STAT3通路,促进ATF3-p-STAT3募集更多HDAC1,下调MGMT启动子区域H3K27ac水平下调,抑制MGMT的转录。这一结果也得到了O6-met G免疫荧光的证实。研究结论:本研究发现EPIC-0307能够选择性地破坏PRADX与EZH2的结合,通过表观调控上调P21和PUMA的表达,导致GBM细胞周期阻滞和凋亡。EPIC-0307还通过下调GBM细胞中DNA修复相关基因的表达,提高TMZ治疗的敏感性。在MGMT阳性的GBM中,EPIC-0307通过ATF3-p STAT3-HDAC1复合体表观沉默MGMT的表达,提高TMZ治疗的敏感性。总体而言,EPIC-0307BAY 73-4506分子式作为靶向PRADX-EZH2互作的表观遗传学潜在药物,在GBM体内外展现抗肿瘤活性,尤其与TMZ联用可作为更有效的治疗方法。