香菇中CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建

香菇Lentinula edodes隶属于担子菌门,是世界第二大食药用菌,具有很高的食用、药用、经济和生态学selleck抑制剂价值,特别是在已有800多年栽培历史的中国,香菇产业发展的更是蒸蒸日上。但由于目前以香菇为对象的分子生物学层面的基础研究相对薄弱,使其在优良品种选育和生物技术应用领域中发展较为缓慢。因此,本研究试图在香菇中构建稳定的CRISPR/Cas9基因编辑系统,为在香菇中实现分子育种提供一种可靠的分子生物学工具。本研究首先在香菇中预测了5个香菇U6 snRNA启动子,并筛选出1个有功能的启动子,同时依据香菇基因组密码子的使用偏好性,对CRISPR/Cas9系统的核心组分cas9基因进行了密码子优化;然后以乳清苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因pyrG为CRISPR/Cas9基因编辑的目的基因设计sgRNA,构建一个同时携带基因编辑系统重要工作元件sgRNA和cas9基因的双元表达载体。最后利用农杆菌介MRTX1133体内实验剂量导的香菇菌丝遗传传化系统将该载体转入香菇单核体中对pyrG基因进行编辑,成功获得了目标基因pyrG发生碱基缺失或插入的香菇单核体突变株peptidoglycan biosynthesis,并经功能筛选后确定其为尿嘧啶营养缺陷型菌株。