宿主限制因子(Host Restriction factor,HRFs)干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon induced tranfood as medicinesmembrane proteins,IFITMs)是一种由干扰素诱导产生的小分子跨膜蛋白,由于具有广谱抗病毒活性和独特的抑制病毒入侵的能力,使其成为近年来抗病毒研究的热点分子。自1996年首次报道IFITMs具有抗病毒活性以来,目前已证明其能限制多种病毒感染,包括甲型流感病毒、埃博拉病毒、严重急性呼吸综合征病毒、艾滋病病毒和寨卡病毒等严重危害人类健康和社会稳定的一些主要病毒,但目前未有IFITMs与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的相关报道。研究表明,IFITMs主要在病毒进入过程中发挥抗病毒活性,特别是干扰包膜和内体膜的融合,或形成融合微孔以阻止病毒进入细胞质。然而,它们的具体机制尚不清楚。本研究以鸡干扰素诱导的跨膜蛋白(chicken IFITMs,chIFITMs)和NDV为研究对象,详细、系统的研究了chIFITMs抑制NDV感染的作用,并解析了其机制。首先,本研究使用DF-1细胞,成功扩增得到三种鸡源IFITMs(chIFITM1、chIFITM2、chIFITM3),对克隆得到的片段进行分析。测序结果显示成功获得与参考基因序列一致的目的基因;同源性分析表明各物种IFITMs氨基酸的同源性均在20%以上,且哺乳动物IFITMs之间的氨基酸序列同源性达50%以上,而chIFITMs与哺乳动物的同源性普遍偏低(30%左右),提示它们虽然属于同一类蛋白,但卵生动物和哺乳动物仍有较大差异;蛋白序列分析表明chIFITMs具有与其他物种相似的结构,包含NTD、IMD、CIL、TMD、CTD等结构域,且具有多处相似的保守位点及序列,如Y20、Gxxx G等,相似的功能位点和功能结构提示chIFITMs可能发挥相似的作用;遗传进化结果反映了各物种IFITMs蛋白的差异,人、鼠、猪等哺乳动物的IFITMs集中聚集在同一较大分支,而chIFITMs则位于区别于其他物种的另一分支,这种结果可能与哺乳动物基因组在相同时间内经历了快速的进化,而鸟类基因组在进化过程中存在大量基因丢失现象有关;拓扑结构、二级结构、三级结构预测发现,chIFITM1的拓扑结构、二级结构、三级结构预测结果基本一致,但chIFITM2的二级结构预测显示3个螺旋结构,而三级结构预测显示2个螺旋结构;chIFITM3的二级结构预测显示3个螺旋结构,三级结构预测显示3个螺旋结构,且CTD区位置也与拓扑结构不符,以上预测虽然对我们了解chIFITMs有一定揭示,但其真实结构还需要我们进一步通过实验确定。目前对chIFITMs的研MRTX1133纯度究多集中于遗传进化、序列分析及抗病毒表型,且缺乏对该家族主要成员chIFITM1、chIFITM2、chIFITM3抗病毒作用系统的分析和比较以及抗病毒机制探索。因此,基于扩增得到的目的片段,构建分别表达chIFITMs的重组真核质粒,通过瞬时过表达初步分析其抗病毒作用。结果证实,chIFITMs瞬时过表达可以显著抑制包括NDV在内的多种病毒在DF-1细胞中的增殖,且chIFITM1、chIFSmoothened Agonist体内ITM2、chIFITM3三者之间的抗病毒作用差异不显著;同时,chIFITMs的抗病毒作用呈现剂量依赖性;另外,在异源细胞中过表达chIFITMs,也显示其具有抗病毒效果但存在细胞差异性,病毒抑制率依次为猪源>鼠源>猴源>人源。为了进一步确证chIFITMs的抗病毒作用并解析其机制,利用Tet-On系统分别构建稳定表达chIFITM1、chIFITM2、chIFITM3的诱导型细胞系,经双抗生素加压筛选后选择阳性细胞进行大量培养,设置不同诱导剂浓度及诱导时间摸索最优表达条件,chIFITM1、chIFITM2、chIFITM3的最佳Dox诱导条件分别为2.5μg/m L 24 h、2.5μg/m L 24 h、5μg/m L 24 h;经Dox诱导后的chIFITM1、chIFITM2、chIFITM3细胞系的目的基因表达量分别增加了1.6×10~5、8.7×10~3、1.7×10~4倍。同时,利用NDV强弱毒株以及水疱性口炎病毒(VSV-EGFP)和流感病毒H3N2、H9N2亚型对构建的细胞系进行了抗病毒能力分析,结果显示过表达细胞系抗病毒作用良好且呈现广谱的抗病毒作用。为进一步解析chIFITMs抗NDV感染的作用机制,首先利用经典的病毒结合-进入实验分析chIFITMs对NDV吸附和进入的影响。结果显示,过表达细胞系经Dox诱导后,病毒吸附过程未受影响,但显著影响病毒进入过程,与对照组相比,chIFITMs过表达组病毒进入程度降低50%以上,chIFITM1与chIFITM2限制病毒进入细胞的水平相当,略高于chIFITM3,但chIFITMs之间无显著性差异。另外,探究了细胞膜流动性与chIFITMs抗病毒作用的关系,结果表明,chIFITMs的过表达降低了细胞膜流动性,提示其可能通过影响细胞膜流动性抑制NDV进入细胞,chIFITM1、chIFITM3组膜流动性降低50%,chIFITM2组膜流动性降低25%。chIFITMs在细胞中发挥作用的最终目的是保护细胞不受病毒感染和侵害,提高细胞存活率。为此,对chIFITMs与病毒诱导的细胞死亡之间的关系进行分析,CCK8检测结果显示,chIFITMs显著性抑制病毒诱导的细胞死亡(P<0.001),各chIFITMs之间保护率无显著性差异,均在30%,结晶紫染色结果与CCK8检测结果相符,chIFITMs组与空载体组相比染色较深,表明细胞存活率更高。最后,为了进一步分析chIFITMs在干扰素介导的抗病毒效应中的作用。首先利用杆状病毒表达系统进行了鸡源III型干扰素(chIFNL3)的表达与制备。在制备过程中,本研究鉴定了一个以前未被鉴定的新的chIFNL,遗传进化分析表明其属于III型干扰素,与chIFNL3同源性为57.1%,该chIFNL位于chIFNL3基因座的1-354 bp处,与chIFNL3共享相同的N端序列(163 bp,54 aa),与chIFNL3不同的是,其在163 bp处没有切割,是连续的354 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),进一步研究发现其能诱导ISGs的表达,并依赖IFN III受体发挥作用,且具有广谱抗病毒活性,以上结果均显示其为一个新的剪接体,命名为chIFNL3a。在此基础上,分析了chIFITMs在chIFNL介导的抗病毒效应中的作用。结果显示,利用RNAi干扰技术瞬时敲降内源性chIFITMs,chIFNL(chIFNL3和chIFNL3a)抑制NDV复制的能力均显著降低,但不同的chIFITMs在不同chIFNL介导的抗病毒活性存在差异,其中chIFITM3对chIFNL3抗病毒活性的影响差异最为显著(P<0.0001),chIFITM1对chIFNL3a抗病毒活性的影响差异最为显著(P<0.001),chIFITM2的干扰对chIFNL3和chIFNL3a的抗病毒作用未产生明显影响,可能是由于其在DF-1细胞中的本底表达较低导致。上述结果显示,不同的chIFITMs对在不同干扰素介导的抗病毒作用中存在差异,这可能是不同干扰素在发挥作用时对chIFITMs的诱导偏好造成的,chIFITM3对chIFNL3介导的抗病毒通路较为重要,chIFITM1对chIFNL3a介导的抗病毒通路较为重要。综上所述,本研究证实了外源性chIFITMs可以显著抑制多种病毒在DF-1细胞中的增殖,三种chIFITMs的抗病毒作用无显著性差异。外源性chIFITMs发挥抗病毒作用的机制可能有以下几点:(1)通过影响病毒进入细胞过程限制病毒在细胞中的复制,降低病毒感染水平;(2)通过调节细胞膜流动性影响NDV Na病毒复制;(3)chIFITMs可以阻止病毒诱导的细胞死亡,提高细胞存活率。另外,内源性IFITMs可以调节chIFNL介导的抗NDV Na病毒作用,内源性IFITMs的减少影响chIFNL3、chIFNL3a在DF-1细胞中的抗病毒作用,但不同的IFITMs对不同的干扰素抗病毒作用的调节存在差异。