蓝莓是一种风味独特、营养丰富的高经济价值小浆果,采后极易腐败变质,但现有技术无法满足市场对优质鲜果的旺盛需求。而黑曲霉(Aspergillus.niger)引发的蓝莓采后腐烂长年造成巨大的采后损失。前期研究表明,麝香草酚(Thymol,THY)作为一种具有广谱抑菌性的植物精油成分,可有效抑制黑曲霉生长繁殖,但稳定性差、挥发性强等缺陷极大限制了THY在生鲜物流领域的应用。本论文首先制备了稳定性和包埋效果良好的麝香草酚多糖复合涂膜剂(TKL),并通过低温贮藏实验验证其应用效果,继而研究了TKL对黑曲霉的生理生化特性的影响;最后整合多组学分析探讨TKL对黑曲霉的抑菌机理。研究结果将为新型绿色蓝莓保鲜技术的开发提供了新思路,为天然抗真菌采后处理技术开发提供重要的理论和技术支撑。主要研究结果如下:(1)通过TKL制备关键工艺参数的优化试验,确定了制备缓释型麝香草酚-β环糊精微胶囊(TMs)的工艺、成膜基质(KL)中KGM/LAG比例和膜剂中TMs的最佳添加量,并对最优TKL进行了结构表征。结果表明,在最佳工艺条件下,TMs包埋率为91.40±0.74%,实际载药量为26.10±0.49 mg/g,具有粒径小、热稳定性和水基润湿性好、气味阈值高等优点,并表现出缓释效果和广谱抑真菌活性;总多糖含量为0.075%(w/v)、KGM/LAG比例为1:2的KL可有效润湿蓝莓表皮蜡质,并在风干成膜后形成自发式气调包装,具有优异阻隔性能;最佳综合抑菌活性的TKL配方(TKL60)为0.22%TMs+0.025%KGM+0.05%LAG(w/v),该涂膜剂各组分相互作用良好,所形成的新型高分子聚合物能与蓝莓表皮蜡质良好的结合,填充原始蜡质缺陷区域,形成一层约为0.39±0.15μm的白色薄膜,显著改善果实外观品质。因此,TKL60是一种有潜力的蓝莓采后处理技术。(2)以空白处理(CK)和KL处理为对照,通过探究TKL60对2℃冷藏条件下蓝莓果实贮藏品质、果皮理化特性、表皮蜡质的影响,评价了TKL60在蓝莓采后保鲜方面的应用效果。结果表明,相较对照组,TKL60显著降低了失重率、腐烂率、果实表面真菌菌落总数,抑制了果实呼吸作用和乙烯释放,延缓了果实软化进程,降低了可滴定酸(TA)、Bafilomycin A1供应商L(+)-抗坏血酸(L-VC)、花青素的降解速率,提高了果实长期冷藏后的感官品质,将蓝莓货架期延长至49 d。此外,TKL60能保持果皮组织中抗氧化酶活性,抑制活性氧(ROS)积累,减轻果皮膜脂过氧化程度,维持果皮细胞结构完整性。同时,TKL60还能显著提高冷藏期内蓝莓蜡质总量,有助于保护蜡质晶体结构,延缓蜡质组分转化,并提高贮藏中后期果皮中表皮蜡质合成途径关键酶活性。相关性分析揭示果实表面真菌菌落总数对蓝莓各理化特性指标影响最为显著,蜡质总量次之。综上所述,TKL60是一种在蓝莓采后保鲜领域具有良好应用效果的涂膜剂,其长效抑菌作用是延长蓝莓货架期的关键因素。(3)通过体外抑菌试验分析了TKL中TMs释放THY含量与抑菌效果的关系,并对TKL60对黑曲霉菌丝生长影响进行了探究。结果表明,KL对黑曲霉菌丝生长无显著影响,TKL中TMs所释放的THY含量与抑菌效果具有正相关性;在TKL包埋状态下THY对黑曲霉的半数最大有效浓度(EC_(50)~(TKL))为99.49±2.80 mg/L,即TKL60对目标菌的毒力剂量约为3/5 EC_(50)~(TKL)。进一步对黑曲霉菌丝细胞生理生化活性指标进行测试,发现TKL60虽然未对细胞膜造成明显损伤,但显著干扰了黑曲霉的正常生理代谢活动,处理组细胞线粒体和脂滴(LD)数量、形态增大,形成大量自噬体,总脂质含量显著增高,可溶性蛋白和ATP含量明显下降;TKL60组ROS水平和线粒体膜电位相较CK分别降低了8.83%和17.11%,柠檬酸合酶(CS)、异柠檬酸脱氢酶(ICDH)、ATP合成酶(ATPase)、己糖激酶(HK)、6-磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)的酶活性下降超过10%,仅有α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)酶活性增幅达31.7Ferrostatin-1抑制剂5%。综上,TKL60对黑曲霉具有一定的抑菌作用,该作用可能与其诱导黑曲霉菌丝代谢紊乱、能量稳态改变有关。(4)采用非靶向代谢组学技术研究了TKL60处理48 h后黑曲霉代谢组学特征,共鉴定出204种显著差异代谢产物(DMs),有70种表达量上调,134种下调。有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子类DMs表达量变化最明显。由TKL60组关键次级代谢标志物变化可知,1,2-二油酸-sn-甘油-3-磷酸-甘油、谷氨酰胺和DI-苹果酸的表达量分别较CK上调75.87倍、1.70倍和1.96倍,而丙酮酸盐、丙酮酸和NAD+表达水平则分别降低至正常状态的31.07%、39.37%和30.27%。KEGG通路富集分析结果显示,TKL60对菌体的氨基糖和核苷酸糖代谢、泛酸和辅酶A生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、丙酮酸代谢和D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢均产生显著影响。综上,TKL60处理后黑曲霉菌体内代谢物的变化及流向大多与脂质、氨基酸和碳水化合物代谢密切相关,TKL60可能通过干扰脂质和NAD+相关核心代谢途径从而抑制黑曲霉菌丝生长。(5)采用TMT蛋白组学技术研究了TKL60处理48 h后的黑曲霉蛋白组学特征。结果鉴定出743个差异表达蛋白(DEPs),其中338个上调,405个下调。亚细胞结果显示,86.54%DEPs集中在metabolomics and bioinformatics细胞质、细胞核和线粒体上。GO功能分析结果表明,参与生物过程、分子功能和细胞组分的DEPs分别有489个、642个和681个;在这些蛋白质中,与抗氧化活性相关GO分类中出现频次最高的是过氧化氢-氧化还原酶(kat G)蛋白A0A117DWC4、过氧化氢酶(CAT)蛋白A0A117DVZ9和A0A100I1U7。TKL60组A0A117DWC4表达量是CK的1.24倍,而A0A117DVZ9和A0A100I1U7蛋白表达量分别下调为原水平的78.03%和71.82%。KEGG通路分析发现,乙醛酸和二羧酸代谢途径富集度的显著性最高,整体呈显著下调趋势;乙醛酸脱氢酶(FDHI)的A2R4H2蛋白、乙酰辅酶合成酶(ACS)的A2QJ30蛋白、苹果酸合成酶(MLS)的A0A117E0R2和A2R4W7蛋白,以及异柠檬酸裂解酶(IL)的A0A100I3Y5蛋白表达量相比CK组显著下调。综上所述,TKL60可能通过损害黑曲霉的抗氧化防御功能引起细胞中NAD+水平下降,从而紊乱碳水化合物代谢来抑制其生长。(6)通过代谢组学和蛋白组学关联分析,探讨TKL60抑制黑曲霉的潜在药物靶点和抑菌机理。结果表明,DEPs和DMs共同参与了69条KEGG通路,TKL60通过干扰黑曲霉细胞中脂质代谢和抗氧化防御体系相关代谢通路,导致碳水化合物代谢和能量代谢途径的整体表达水平显著下调。筛选重要KEGG通路并重点分析相互关联的DMs和DEPs,结果显示3-氧酰基[酰基-载体-蛋白质]还原酶(Fab G)的A0A124BXR8蛋白和kat G酶的A0A117DWC4蛋白可能是TKL60抑制黑曲霉菌丝生长的药物靶点。经验证,与CK相比,TKL60处理后黑曲霉kat G酶和Fab G酶活性分别升高13.79倍和6.62倍,基因kat G和At WU＿09702的相对表达量显著上调12倍以上;TKL60组细孢内[NADH/NAD+]比值和棕榈酸水平分别提高了4.29倍和1.34倍,而H_2O_2含量则降至正常状态下的32.06%。综上所述,TKL60对黑曲霉的抑制作用机理可能是该涂膜释放出低于EC_(50)~(TKL)剂量的THY,与A0A124BXR8和A0A117DWC4蛋白结合后促使kat G酶和Fab G酶的过表达,刺激细胞产生抗毒素反应,产生大量TAG形成LDs吞噬THY,同时提高胞内ROS清除率,从而造成NAD+大量消耗,导致细胞碳代谢紊乱、能量稳态失衡,限制黑曲霉菌丝生长。