目的 本研究旨在探讨黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)对巨噬细胞的免疫活性功能的调控作用和对环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)诱导的免疫抑制小鼠的保护作用及机制,为AS-Ⅳ在防治骨髓抑制中的应用提供实验依据。方法 1.检索TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM等数据库,获取黄芪皂苷类化合物信息;应用Swiss Target Prediction、Stitch等数据库,获取和预测黄芪皂苷类化合物的潜在作用靶点;检索Genecards等数据库,获取骨髓抑制疾病相关作用靶点;应用STRING数据库、Venny 2.1.0、Cytoscape 3.6.0等构建黄芪皂苷类化合物抗骨髓抑制疾病共同作用靶点的PPI和“成分-靶点-疾病”网络图,以预测黄芪皂苷类化合物抗骨髓抑制的核心化合物和关键靶点;应用Metascape数据库,对黄芪皂苷类化合物抗骨髓抑制疾病共同作用靶点进行GO和KEGG通路富集分析,以预测黄芪皂苷类化合物抗骨髓抑制的潜在信号通路。2.应用MTT法检测AS-Ⅳ对巨噬细胞RAW264.7活性的影响,筛选出合适的给药浓度并开展后续实验;将巨噬细胞RAW264.7随机分为阴性对照组、AS-Ⅳ组(1 μM、5 μM和10μM)和LPS组(1 μg/mL);应用平板克隆法检测AS-Ⅳ对增殖能力的影响;应用划痕法检测AS-Ⅳ对迁移能力的影响;应用结晶紫染色法检测AS-Ⅳ对黏附能力的影响;应用中性红法检测AS-Ⅳ对吞噬能力的影响;应用Griess法和ELISA法分别检测AS-Ⅳ对分泌一氧化氮(Nitric oxide,NO)和细胞因子含量水平的影响;应用生化试剂盒分别检测 AS-Ⅳ对活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量水平的影响。以检测AS-Ⅳ对巨噬细胞RAW264.7免疫活性功能的影响。3.应用qRT-PCR和Western blot技术分别检测AS-Ⅳ对巨噬细胞RAW264.7的HIF-1α/NF-κB信号通路关键基因及蛋白表达水平的影响;应用Western blot技术检测抑制剂单独或联合AS-Ⅳ对HIF-1α/NF-κB信号通Berzosertib体内实验剂量路关键蛋白表达水平的影响。以研究AS-Ⅳ调控巨噬细胞RAW264.7免疫活性功能的作用机制。4.将C57BL/6J小鼠随机分为6组:正常对照组(NC)、模型对照组(MC)、阳性药对照组(PC,盐酸左旋咪唑,40 mg/kg)、AS-Ⅳ低剂量组(AS-Ⅳ-L,25 mg/kg)、AS-Ⅳ中剂量组(AS-Ⅳ-M,50 mg/kg)和 AS-Ⅳ高剂量组(AS-Ⅳ-H,100 mg/kg),给药方式为灌胃,每天灌胃一次,连续9天;除NC组外,其余组小鼠于第3、4、5天腹腔注射CTX(80 mg/kg),连续3天,建立CTX诱导的C57BL/6J小鼠免疫抑制模型;给药期间,每天观察小鼠一般状况,称量体质量;给药结束后,取血并处死所有小鼠,摘取股骨、脾脏、胸腺、肝脏、心脏、肺脏和肾脏等并称重;应用苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色,观察各组小鼠主要脏器组织的病理形态学变化;应用血细胞分析仪检测血液学指标;提取骨髓细胞并计数,经巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)诱导为小鼠骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophage,BMDM);应用流式细胞LY2157299分子式术鉴定BMDM;应用中性红法检测BMDM的吞噬能力;应用Griess法检测BMDM分泌NO的含量水平;提取脾细胞,应用LDH法和MTT法分别检测NK细胞活性和淋巴细胞转化活性。以研究AS-Ⅳ在体内对CTX诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能调控和抗骨髓抑制作用。结果 1.黄芪皂苷类化合物与骨髓抑制疾病相关的共同作用靶点共计335个;GO富集分析结果显示共同作用靶点主要与“转录因子结合”、“调控小分子代谢过程”、“转录调控复合物”等生物过程相关;KEGG通intrauterine infection路富集分析结果显示共同作用靶点主要与“HIF-1信号通路”、“NF-κB信号通路”等信号通路相关;PPI网络图分析结果显示关键靶点包括HIF1A、IL1B、IL6、NOS3、RELA、TNF、VEGFA等,与炎症、免疫、缺氧和HIF-1α/NF-κB信号通路等密切相关;“成分-靶点-疾病”三级网络图分析结果显示,AS-Ⅳ为核心化合物;分子对接结果显示AS-Ⅳ与HIF1A、RELA等关键靶点之间具有良好的结合活性。2.AS-Ⅳ在浓度小于25μM时,对巨噬细胞RAW264.7的活性无显著影响;AS-Ⅳ可以促进巨噬细胞RAW264.7的克隆体形成、划痕愈合和贴壁,增强增殖、迁移、黏附和吞噬能力;AS-Ⅳ可以促进分泌NO、TNF-α、IL-6和IL-1β,抑制分泌IL-10和TGF-β1等生物活性物质;AS-Ⅳ可以升高ROS、MDA和GSH的含量水平,降低SOD的含量水平。3.AS-Ⅳ可以升高巨噬细胞RAW264.7的HIF-1α、NF-κB p65、IKKβ、PHD3、TNF-α和IL-6,降低IκBα的 mRNA 表达水平;AS-Ⅳ可以升高 HIF-1α、p-NF-κB p65、PHD3的蛋白表达水平;AS-Ⅳ可以分别逆转经YC-1、PDTC、Roxadustat诱导的HIF-1α、p-NF-κB p65、PHD3蛋白表达水平的降低。4.AS-Ⅳ可以促进CTX诱导的免疫抑制小鼠的体质量和免疫器官指数的升高;AS-Ⅳ可以修复免疫器官和主要脏器的病理形态学变化;AS-Ⅳ可以增加血细胞和骨髓细胞的数量;AS-Ⅳ可以增强NK细胞活性和淋巴细胞转化活性;AS-Ⅳ可以增强BMDM的吞噬能力;AS-Ⅳ可以促进BMDM分泌NO,以及升高血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量水平。结论 AS-Ⅳ可以显著缓解CTX诱导的骨髓抑制症状,并可能通过激活HIF-1α/NF-κB信号通路增强巨噬细胞的免疫活性功能,为AS-Ⅳ作为具有潜在价值的骨髓微环境调节剂的临床应用提供可靠实验依据。