本试验以经典的大肠杆菌LPS刺激的肉仔鸡免疫应激模型为研究对象,通过体内饲养试验和体外淋巴细胞培养试验相结合的方法,就黑沙蒿黄酮(Artemisia ordosica flavonoids,AOF)对免疫应激的缓解作用及可能的机制展开了系统研究。试验一:黑沙蒿粗黄酮对肉仔鸡生长性能和免疫、抗氧化功能的影响试验采用单因素随机设计,选取240只1日龄爱拔益加(AA)雄性肉仔鸡,按照体重相近原则随机分5个处理组,每个处理6个重复,每个重复8只鸡。对照组肉仔鸡饲喂基础日粮,试验组日粮则在基础日粮中分别添加250、500、750和1000mg/kg的黑沙蒿粗黄酮(AOCF),试验为期42 d,分为前期1-21 d和后期22-42 d。结果表明:日粮添加不同剂量的AOCF可以提高肉仔鸡ADG,降低F/G,促进机体生长发育;上调血清Ig G和细胞因子(IL-2、IL-4及IL-6)的水平,增进机体免疫能力;增加血清CAT、GPx、T-SOD的活性及TAC,降低MDA的含量,增强机体抗氧化功能。综合上述指标考量,当添加剂量为750 mg/kg时,AOCF对肉仔鸡生长、免疫和抗氧化性能的促进效果较为理想。试验二:黑沙蒿粗黄酮对LPS诱导的肉仔鸡免疫应激的缓解作用及机理研究综合试验一中生长性能、免疫和抗氧化相关指标的结果,选择750 mg/kg的AOCF作为肉仔鸡日粮中的最适添加剂量,随后在本试验中根据该添加剂量设置低(500 mg/kg)、中(750 mg/kg)、高(1000 mg/kg)3个AOCF添加水平。选取240只健康且体重相近(38.14±0.36 g)的1日龄雄性AA肉仔鸡,采用完全随机试验设计,分为5个处理组,每组6个重复,每个重复8只鸡,分组如下:(1)对照组,饲喂基础日粮并腹腔注射生理盐水;(2)LPS组,饲喂基础日粮并腹腔注射LPS溶液;(3)AOCF低剂量组,在基础日粮中添加500 mg/kg的AOCF并腹腔注射LPS溶液;(4)AOCF中剂量组,在基础日粮中添加750 mg/kg的AOCF并腹腔注射LPS溶液;(5)AOCF高剂量组,在基础日粮添加1000 mg/kg的AOCF并腹腔注射LPS溶液。试验期为42 d,分为预饲期(第0-15 d)、应激期(第16-28 d)、恢复期(第29-42d)。分别在试验第16、18、20、22、24、26、28 d给各处理组肉仔鸡腹腔注射7.5m L/kg体重的生理盐水或等量的LPS溶液(LPS溶液浓度为100μg/m L生理盐水)。结果表明:(1)日粮添加AOCF缓解了LPS诱导的免疫应激肉仔Elexacaftor鸡脾脏指数的升高和法氏囊指数的降低,并通过下调TLR4、My D88、TRAF6、NF-κB p65、NF-κB p50、IL-1β、IL-6基因和NF-κB p65、IL-1β蛋白的过表达及NF-κB p65的磷酸化水平,上调PPARγ的m RNA和IκBα的基因及蛋白表达,降低IκBα的磷酸化,减少IL-1β和IL-6的过度产生,抑制机体的炎症反应,从而缓解LPS引起的免疫应激;(2)日粮添加AOCF可以抑制由LPS导致的Keap1基因和蛋白的过表达,增加Nrf2和SOD的基因及蛋白表达,上调CAT、GPx的m RNA和HO-1的蛋白表达水平,从而提高抗氧化酶的活性和TAC,并减少ROS和氧化副产物(MDA、8-OHd G、PC)的过度生成,改善机体的氧化损伤,从而缓解LPS引起的免疫应激;(3)AOCF可以通过缓解LPS刺激下免疫应激肉仔鸡血清应激相关激素ACTH、CORT升高和生长相关激素IGF-1降低,改善机体的免疫和抗氧化能力,提高免疫应激肉仔鸡CP和EE的表观代谢率来缓解LPS导致的生长性能下降,增加免疫应激状态下肉仔鸡的BW、ADG和ADFI。试验三:黑沙蒿黄酮的分离纯化及其对LPS刺激的肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫和抗氧化功能的影响(1)通过AB-8大孔树脂并聚酰胺柱层析对AOCF中的黄酮类化合物进行分离纯化,得到纯度更高的黑沙蒿黄酮(由55.61%提高至73.59%),采用肉仔鸡外周血淋巴细胞(Peripheral blood lymphocytes,PBLs)建立体外培养模型,探究黑沙蒿黄酮(AOF)对LPS诱导的免疫应激肉仔鸡PBLs免疫和抗氧化功能的影响,并为后续体外试验筛选出AOF的最适添加水平为100μg/m L。试验采用2×6因子设计,共设12个处理,即主效应包括2个应激状态(添加10μg/m L LPS的应激组和不含LPS的非应激组)和6个AOF添加水平(0、25、50、100、200和400μg/m L),每个处理6个重复孔。结果表明:(1)LPS非应激培养条件下,AOF提高细胞培养液中了IL-2、IL-4、IL-6、Ig A、Ig G和Ig M的含量;LPS应激培养条件下,AOF缓解了细胞培养液中IL-1β、IL-2、IL-6的升高和IL-4、Ig A、Ig M的降低;(2)LPS非应激培养条件下,AOF降低了细胞培养液中ROS、MDA、PC和8-OHd G的水平,提高了CAT、T-SOD、GPx的活性和TAC;LPS应激培养条件下,AOF缓解了细胞培养液中ROS、MDA、PC、8-OHd G水平的升高和T-SOD、GPx、CAT活性及TAC的降低;(3)AOF增强了肉仔鸡PBLs的活力。综合上述指标考量,100μg/m L的AOF对肉仔鸡PBLs活力、免疫和抗氧化性能的作用效果较为理想。试验四:黑沙蒿黄酮通过NF-κB信号途径缓解肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的机理研究本试验在试验三的基础上,以LPS诱导的免疫应激肉仔鸡PBLs为研究对象,通过添加NF-κB信号通路的特异性抑制剂PDTC阻断该通路,进而从NF-κB信号通路研究AOF缓解PBLs免疫应激的作用机制。采用单因素完全随机设计,共设7个处理:CON组、LPS组、AOF组、AOF+PDTC组、LPS+PDTC组、LPS+AOF组、LPS+AOF+PDTC组,每个处理6个重复。结果表明:正常培养条件下,AOF增加了肉仔鸡PBLs中TLR4、NF-κB p65、IκBα的基因表达,上调了IL-1β、IκBα的蛋白表达和NF-κB p65的蛋白表达和磷酸化水平,促进了IL-1β和IL-6的产生,通过适度激活NF-κB信号通路发挥免疫增强作用;LPS刺激条件下,AOF缓解了由LPS导致的TLR4、My D88、NF-κB p65、IL-1β、IL-6基因水平和NF-κB p65蛋白水平和磷酸化水平的过度升高,上调了IκBα的基因表达和蛋白表达androgenetic alopecia并下调了IκBα的磷酸化,降低了IL-1β的基因和蛋白的过表达,抑制了IL-1β、IL-2、IL-6的过度分泌,同时提高了IL-4、Ig A、Ig G、Ig M的含量,通过抑制NF-κB信号通路的过度激活发挥抗炎活性,从而缓解LPS导致的肉仔鸡PBLs的免疫应激。试验五:黑沙蒿黄酮通过Nrf2信号途径缓解肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的机理研究本试验在试验三的基础上,以LPS诱导的免疫应激肉仔鸡PBLs为研究对象,通过添加Nrf2信号通路的特异性抑制剂ML385阻断该通路,进而从Nrf2信号通路研究AOF缓解PBLs免疫Alpelisib应激的作用机制。采用单因素完全随机设计,共设7个处理:CON组、LPS组、AOF组、AOF+ML385组、LPS+ML385组、LPS+AOF组、LPS+AOF组+ML385组,每个处理6个重复。结果表明:AOF可以下调肉仔鸡PBLs中Keap1的基因表达和蛋白表达,上调CAT、GPx的基因表达、HO-1的蛋白表达和Nrf2、SOD的基因表达和蛋白表达,通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化活性,并能够缓解LPS对Nrf2信号通路的抑制作用,从而减轻LPS诱导的肉仔鸡PBLs的免疫应激。综上所述,日粮添加AOCF不仅可以提高常规饲养条件下肉仔鸡的免疫和抗氧化能力,发挥促生长作用,而且可以缓解由LPS诱导的免疫应激肉仔鸡促炎因子含量的升高、ROS及氧化副产物水平的增加、抗氧化酶活性的降低,来改善机体的免疫应激和氧化损伤,这可能与AOF可以抑制NF-κB信号通路的过度活化、激活Nrf2信号通路发挥免疫调节和抗氧化作用有关。