药物共晶是药物活性成分(Active Pharmaceutical Ingredient,API)与生物相容性的小分子前体(Co-Crystal Former,CCF)以氢键等非共价弱作用力结合而成的超分子体系,其对API的溶解度及生物利用度等不良性质的改善优势越来越被关注。通常认为,药物共晶在溶解状态下二组分以自由的单体分子存在。近年来,越来越多的文献报道共晶溶解后显示了不同于二组分物理混合物(Physical Mixture,PM)的生物学行为,API与CCF在分子层面存在协同作用,但具体机制鲜见报道。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是临床常用的一线抗肿瘤药物,主要用于治疗皮肤癌、胃肠道癌、肝癌和乳腺癌等。然而,5-FU具有的渗透性较低、半衰期短、代谢快、首过效应明显、不良反应严重等不良因素限制了其临床应用,故通过共结晶技术改善5-FU的生物利用度以及达成5-FU与CCF的协同活性具有重要意义。基于此,本论文选用具有生物学活性的氨基酸和没食子酸(Gallic Acid,GA)为CCF筛选5-FU共晶,其一,通过共晶的筛选,改善5-FU的药物动力学特征;其二,基于氨基酸和GA前体的生物学活性,考察5-FU与CCF之间二组分的协同作用及机制。第一部分:基于细胞代谢组学的5-氟尿嘧啶共晶API与CCF二组分协同作用机制研究目的:考察5-FU、苯丙氨酸(Phenylalanine,PHE)、5-FU/PHE PM和5-FU-PHE共晶在B16 F10(B16)细胞上的毒性,采用细胞代谢组学技术探讨PM与共晶的毒性差异的机制。方法:采用溶剂辅助研磨法制备5-FU-PHE共晶。应用粉末X射线衍射(Powder X-Ray Diffraction,PXRD)和差示扫描量热(Differential Scanning Calorimetry,DSC)对共晶进行表征;MTT试验考察5-FU、5-FU/PHE PM和5-FU-PHE共晶在B16细胞上的毒性;采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱技术(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)检测内源性代谢物的保留时间和质谱信息;构建正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)模型计算变量投影重要度(Variable Importance for the Projection,VIP),并使用t检验、FC检验筛选差异代谢物用于通路分析。结果:成功制备了5-FU-PHE共晶;5-FU、PM和共晶对B16细胞的IC_(50)分别为7.61±0.46、7.55±1.65和4.08±0.47μM,PM与共晶之间有统计性差异(p<0.01);构建了代谢组学的OPLS-DA模型,得到12种差异代谢物;分析代谢途径可知,PM和共晶对B16细胞的毒性差异来源于嘌呤代谢、醚脂质代谢和甘油磷脂代谢途径的不同。结论:5-FU-PHE共晶体系中,嘌呤、甘油磷脂和醚脂质代谢通路与细胞凋亡和抗增殖相关,PM和共晶在上述3种通路上表现出来的差异是二者细胞毒性差异的来源。代谢组学策略为共晶和PM之间的细胞毒性差异提供一种可能的机制解释。第二部分:5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的结构解析与体内外评价目的:以肌氨酸(Sarcosine,SAR)为CCF,制备5-FU-SARCompound 3化学结构共晶。培养共晶的单晶体并进行晶体结构解析;考察共晶的药物动力学特征以及SAR对5-FU细胞毒性的影响。方法:采用溶剂辅助研磨法制备5-FU-SAR共晶粉末,采用溶剂缓慢蒸发法培养单晶体。应用单晶X射线衍射(Single Crystal X-Ray Diffraction,SC-XRD)、PXRD、DSC、傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infra Red Spectroscopy,FT-IR)、Raman光谱法对共晶进行了表征;UV-VIS方法测定共晶体系的溶解度、溶出度、油水分配系数和跨膜渗透性能;建立了高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定大鼠血浆中5-FU浓度的方法,考察5-FU、PM和共晶分别使用口服或腹腔注射给药时在SD大鼠体内的药物动力学差异;MTT法考察5-FU-SAR共晶体系在B16、4T1、BEL-7402、A549和MCF-7细胞中的抗肿瘤活性,并应用流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果:单晶结构解析表明该共晶结晶于三斜晶系P-1空间群,晶胞参数为a=7.5581(8)?,b=9.8838(11)?,c=10.4001(9)?,α=67.839(9)°,β=78.166(8)°,γ=77.063(9)°。每个不对称单元包含一个SAR两性离子和两个5-FU分子。SAR与5-FU分子通过多种N-H···O氢键连接成三维超分子网络。共晶的溶出度、渗透性、油水分配系数均优于5-FU和PM;口服给药时,相比于5-FU,共晶的AUC由369.73±48.76μM·h升至511.03±115.59μM·h;腹腔注射给药时,5-FU和共晶的AUC分别为277.12±66.33和406.52±119.44μMFulvestrant价格·h;相比于5-FU,共晶在4T1和BEL-7402细胞上表现出了二组分协同增强的抗肿瘤活性,而在MCF-7中趋势相反;相比于5-FU,共晶诱导了更强的S期抑制和更强的细胞凋亡。结论:得到了5-FU-SAR新共晶的单晶体并解析了结构;该共晶Biopsy needle比5-FU具有更优异的理化性质和更高的生物利用度,并在不同细胞上表现出选择性肿瘤抑制能力。第三部分:5-氟尿嘧啶-精氨酸共晶的筛选、评价与降低心脏毒性的研究目的:分别应用具有NO释放潜力的L-精氨酸(L-Arginine,L-ARG)和D-精氨酸(D-ARG)与5-FU构建共晶并考察共晶的细胞毒性、NO释放效率以及体内外缓解5-FU导致的心脏毒性的能力。方法:采用溶剂辅助研磨法制备5-FU-ARG共晶,应用PXRD、DSC、FT-IR、圆二色谱法(Circular Dichroism,CD)对共晶进行表征;评价共晶体系的溶解度、溶出度、油水分配系数和跨膜渗透性能;考察了5-FU、D-ARG/5-FU PM和D-ARG-5-FU共晶分别在口服和腹腔注射给药条件下SD大鼠体内的药物动力学差异;MTT试验考察5-FU-ARG共晶体系在B16、4T1、BEL-7402、A549和MCF-7细胞中的抗肿瘤活性,并应用流式细胞术检测细胞周期和凋亡。采用DAF-FM DA为探针,应用共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)技术,观测细胞的NO释放;应用Wistar大鼠模型,采用腹腔注射方法,通过测定血清中乳酸脱氢酶(NAD-dependent Lactate Dehydrogenases,LDH)、心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin I,c Tn I)和肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB,CK-MB)水平评价5-FU诱导的急性心脏毒性及ARG对心脏毒性的缓解。结果:制备了L-ARG-5-FU和D-ARG-5-FU共晶。同浓度的溶液中共晶比PM的旋光活性更高,间接证明了溶液中共晶与PM的存在形式不同,共晶溶液中API与CCF之间的氢键仍然存在;共晶的溶解度、溶出度、渗透性均优于5-FU。水中的溶解度由147.47±4.52 m M提升至1932.22±37.7 m M(L)和1968.84±17.53 m M(D);在p H=1.2的HCl介质中,溶解度由145.95 m M提升至1787.56±13.23 m M和1757.72±24.29m M,结果均具有显著性差异(p<0.001);共晶在BEL-7402细胞上诱导了更强的细胞毒性,共晶增强了对G2/M期细胞的抑制;而在HUVEC细胞上共晶的毒性弱于5-FU;D型共晶在细胞和动物水平上均具有缓解5-FU的心脏毒性的能力,其口服/腹腔注射方式下的药物动力学性能相比于5-FU和PM均有明显改善。结论:应用手性ARG分别制备了共晶,两种共晶在体外理化性质上没有显著差异,但D-ARG-5-FU共晶在缓解5-FU诱导的心脏毒性方面有较大优势。第四部分:5-氟尿嘧啶-没食子酸共晶的筛选与体内外药效学评价目的:构建基于抗肿瘤活性天然酚酸—GA的5-FU-GA共晶,并考察其理化性质、口服生物利用度和体内外抗肿瘤活性及机制。方法:应用溶剂辅助研磨法制备5-FU-GA共晶,采用PXRD、DSC、FT-IR、Raman光谱和扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope,SEM)对共晶进行了表征;采用HPLC测定共晶体系的溶解度、溶出度、油水分配系数和跨膜渗透性能;应用Sprague-Dawley(SD)大鼠模型考察5-FU、PM和共晶口服药物动力学差异;MTT法考察5-FU-GA共晶体系在4T1细胞中的抗肿瘤活性,并使用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;应用吖啶橙(Acridine Orange,AO)染色法和CLSM观测细胞的酸性自噬囊泡用于评价自噬;采用4T1细胞和BALB/c小鼠构建荷瘤模型用于考察体内抗肿瘤活性。结果:制备了5-FU-GA共晶。得益于共晶油水分配系数及渗透性的提高,其表现出更高的生物利用度;共晶的形成增强了对细胞G0/G1和G2/M期的抑制,诱导了细胞中的过度自噬,从而增强了体外的抗肿瘤活性;口服或腹腔注射给药时,共晶均具有最高的抗肿瘤活性。结论:5-FU-GA共晶相比于5-FU具有优异的理化性质、口服生物利用度,通过对G0/G1和G2/M期的细胞的抑制和过度激活细胞自噬可以在体内外表现出更高的抗肿瘤活性。