急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是由于髓系造血干细胞恶性增殖,未成熟细胞分化受阻导致的恶性疾病,建立可以评估AML治疗有效性和安全性的疾病模型迫在眉睫。非人灵长类动物与人类的血液系统发育相近,将引起AML的驱动基因导入恒河猴造血干细胞,阻断造血系统的成熟分化,可以有效诱导AML发生。基于此,本研究通过病毒包装体系的建立和转导条件的优化,成功将AML高频突变基因KRASG12D/PML-RARα共转导恒河猴造血干细胞,从而为AML治疗药物评估方法建立提供了较好的细胞模型。1.三种病毒载体包装体系的建立和转导条件的优化本研究建立了逆转录病毒、慢病毒和伪慢病毒三种病毒载体包装体系。在逆转录病毒包装体系中,Belumosudil使用293Vec-BaEV细胞系包装,滴度达2.33±0.14×109 TU/mL。慢病毒载体使用第二代表达系统,滴度达6.52±0.87×108 TU/mL,与三代系统相比高3倍。伪慢病毒在慢病毒包装体系基础上,使用二代表达系统,将水泡性口炎病毒蛋白VSV-G替换为狒狒内源性包膜蛋白BaEVRless和BaEVITR,包膜蛋白质粒的量提高至7 μg,目的质粒和包装质粒均为8.6 μg,血清浓度10%,成功假型化;伪慢病毒包装滴度达2.26±0.73×108 TU/mL,提高了 80倍左右。使用AML细胞系KG1对三类病毒载体进行转导条件的优化,结果显示,逆转录病毒最优转导条件是:使用Vectofusin-1(10μg/mL)作为转导增强剂,MOI=10,病毒和转导试剂混合时不添加血清,2 mL转导体系,离心促转导条件为400×g,90 min,4℃,目的基因表达率为86.64%;慢病毒最优转导条件是:同时使用LentiBOOST(1 mg/mL)、Polybrene(0.89μM)和IX(2 μM)三种转导增强剂,MOI=50,离心促转导条件为1200 ×g,90min,4℃,目的基因表达率为13.86%;伪慢病毒最优转导条件是:使用Vectofusin-1(10 μg/mL)作为转导增强剂,MOI=50,离心促转导条件为400 ×g,90min,4℃,目的基因表达率为76.83%。在最优转导条件下,伪慢病毒和逆转录病毒载体转导效率较高。2.KRASG12D/PML-RARα病毒对恒河猴造血干细胞的共转导将KRASG12D-GFP/PML-RARα-PuroR这对目的基因均分别包装为逆转录病毒和伪慢病毒载体,只有逆转录病毒载体能够共转导恒河猴造血干细胞,KRASG12D-GFP表达率26.43%,荧光显微镜下可见绿色荧光;PML-RARα-PuroR成功获得表达,表现出明显的Puro抗性。共表达的细胞状态良好,10天内增殖了 5倍,细胞Aβ pathology活力达到94.40%。回输至小鼠体内36天后,在小鼠骨髓细胞中检测到GFP荧光,且同时具确认细节有Puro抗性,可见KRASG12D-GFP和PML-RARα-PuroR稳定整合入造血干细胞基因组,并实现长期稳定表达。本研究通过病毒包装体系的建立和转导条件的优化,成功向恒河猴造血干细胞中导入KRASG12D-GFP/PML-RARα-PuroR基因,为AML临床疾病进展和治疗效果的评估提供了一个良好的细胞模型。