硒在人类和脊椎动物的生长发育起着至关重要的作用,它对于抗氧化、预防糖尿病、预防乳腺癌、肺癌和结肠癌等常见癌症有重要的作用,适当补充硒对机体有益,然而,硒的有益浓度与有害浓度之间的范围十分狭窄,细胞中硒含量过高会导致发育缺陷和疾病。有关硒引起斑马鱼胚胎严重畸形的报道较多,但关于硒过量引起心血管缺陷的机制研究较少。因此,本研究以斑马鱼(Danio Rerio)胚胎为研究对象,通过硒代蛋氨酸暴露实验探究硒对斑马鱼胚胎的心血管系统、脂质代谢和硒转运的影响。通过低密度脂蛋白受体相关蛋白2b(lrp2b)基因的敲降和过表达实验验证了lrp2b基因在硒诱导的心血管缺陷中的关键作用。本文的主要结果如下:(1)本研究首先使用不同浓度(0.25μM、0.5μM、1μM和2μM)硒代蛋氨酸对受精后的斑马鱼Medical geology胚胎进行暴露实验。研究结果表明:当硒代蛋氨酸浓度高于0.5μM时,斑马鱼胚胎开始出现心包水肿、脊椎侧弯等表型;当硒代蛋氨酸浓度高于1μM时,在96 hpf之前胚胎几乎全部死亡。随着暴露浓度的增加,与对照组相比,硒暴露组胚胎的畸形率逐渐升高。0.5μM硒代蛋氨酸暴露的畸形率(63%)高于0.25μM硒代蛋氨酸暴露的畸形率(14%),0.5μM硒代蛋氨酸暴露的死亡率(25%)低于1μM(87%)和2μM硒代蛋氨酸暴露的死亡率(98%)。因此,本研究选用0.5μM作为后续研究硒对斑马鱼胚胎心血管毒性的浓度。(2)通过进一步实验观察,我们发现0.5μM硒代蛋氨酸暴露下,斑马鱼胚胎出现心包水肿、心率降低、尾部红细胞堆积,流向心脏的红细胞出现异位累积等现象。硒暴露下转基因fli1-e GFP的斑马鱼出现严重的血管畸形,包括节间血管断裂而失去完整性,节间血管生长不全以及节间血管畸形;硒暴露下转基因myl7-e GFP的斑马鱼胚胎出现了心脏形态的变化,且心房与心室面积比例显著增加。q RT-PCR结果表明,硒暴露引起胚胎心血管发育相关基因表达的改变。(3)为研究硒暴露对脂质代谢和硒代谢影响,本研究首先通过油红O染液(Oil Red O)标记中性脂肪,结果表明硒暴露组胚胎发生肝脏脂肪变性现象,并且甘油三酯和总胆固醇的含量显著增加。ICP-MS结果表明硒暴露组(0.78 mg/kg)总硒含量显著高于对照组(0.1 mg/kg),证明硒通过水体暴露的方式进入胚胎体内并在胚胎中富集。随后,本研究通过q RT-PCR和WISH检测了脂质代谢和硒代谢相关基因的表达。研究结果表明,在检测的脂质代谢相关基因中,硒暴露组脂质合成相关基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(hmgcra)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶1(hmgcs1)、脂肪酸合成酶(fasn)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(scd)和乙酰辅酶A羧化酶α(acaca)的表达水平无显著变化,脂类分解selleck相关基因肉毒碱棕榈酰基转移酶1Aa(cpt1aa)、含Patatin样磷脂酶域蛋白2(pnpLEE011采购la2)和过氧化物酶体酰辅酶A氧化酶1(acox1)的表达水平显著下调。在检测的硒代谢相关基因中,24 hpf时lrp2b表达量显著下调,低密度脂蛋白受体相关蛋白8(lrp8)和硒蛋白P(sepp1)的表达显著上调,96 hpf时lrp2b和lrp8的表达显著下调。其中lrp2b和lrp8基因不仅是低密度脂蛋白受体(LDLR)家族的成员,同时也与硒代谢密切相关。(4)为了进一步研究lrp2b基因在硒诱导斑马鱼心脏缺陷中的关键作用,本研究通过敲降和过表达实验进行lrp2b基因功能初步验证。lrp2b敲降胚胎表现出与硒胁迫胚胎相似的心脏缺陷,lrp2b的过表达挽救了硒诱导的心脏缺陷,表明lrp2b可能在调节硒心脏毒性中发挥关键作用。综上所述,我们的研究评估了过量硒的心血管毒性以及过量硒诱导的脂肪代谢和硒代谢紊乱,找到了硒毒性作用的靶基因,并揭示了硒暴露下斑马鱼胚胎心血管缺陷的分子机制。