研究背景:神经管畸形(Neural tube defects,NTDs)是一类预后不良的中枢神经系统先天性出生缺陷,其病因复杂且机制尚不明确。神经管闭合(Neural tube closure,NTC)是一个精细协调的过程,受遗传和营养环境因素的影响。当NTC过程某一环节出现异常,可导致NTDs的发生。因此,深入研究NTDs的发病机制有助于全面了解其致病因素,有效防治NTDs发生,对提高人口质量有重要作用。叶酸(FolColforsinate acid,FA)缺乏是引起NTDs发生的主要营养因素。叶酸的异常代谢可引起NMCC950TC发生异常诱发NTDs。叶酸转化成四氢叶酸作为甲基供体参与一碳单位的转移过程,调节DNA甲基化(DNA methylation)修饰。DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰,参与哺乳动物生命周期中发育、代谢等调节过程。DNA甲基化主要由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化。在DNMT酶的作用下,基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5位碳原子共价结合一个甲基基团,形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)。DNA羟甲基化(DNA hydroxymethylation)修饰由10-11易位(Ten-eleven-translocation,TET)蛋白通过级联氧化反应促进5mC转化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC),并逐步转化为5-甲酰嘧啶(5-formylcytosine,5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC),引起DNA羟基化修饰发生。既往研究表明,人体中5hmC在不同组织的分布具有明显差异,在脑组织中5hmC含量最高,5hmC在中枢神经系统中参与多种重要调节。研究表明叶酸缺乏可引起细胞氧化还原反应增多,导致异常的DNA羟甲基化发生。然而,在叶酸缺乏情况下,DNA羟甲基化修饰对NTDs发生中的调控作用及分子机制目前尚未明确。研究目的:探究叶酸缺乏条件下DNA羟甲基化修饰在NTDs发生发展中的作用机制,利用表观遗传学方法研究叶酸缺乏对NTDs的发病影响,推动NTDs领域发病机理的新认识,提供NTDs预防治疗和药物筛选的新靶标,也为同类出生发育缺陷疾病提供重要的参考价值。研究方法:1.构建叶酸缺乏的小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells,mESCs)模型,利用转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)筛选差异表达基因,通过基因功能注释(Gene ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析预测叶酸缺乏引起的功能变化。2.叶酸缺乏mESCs模型中,RT-qPCR检测DNA羟甲基化酶和DNA甲基化酶的转录水平变化。3.羟甲基化DNA免疫沉淀测序(Hydroxymethylated DNA immunoprecipitation sequencing,hMeDIP-seq)和甲基化DNA免疫沉淀测序(Mmedullary rapheethylated DNA immunoprecipitation sequencing,MeDIP-seq)检测叶酸缺乏mESCs模型中5hmC和5mC的富集情况,利用生物信息学技术筛选发生显著变化的NTDs相关通路及下游基因。4.染色质免疫共沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)检测叶酸缺乏mESCs模型中组蛋白H3赖氨酸27位点乙酰化(Histone 3 lysine 27 acetylation,H3K27ac)的富集情况,采用生物信息学技术分析筛选出的NTDs相关基因在叶酸缺乏条件下H3K27ac富集水平变化。5.构建叶酸缺乏及叶酸回补mESCs模型,利用RT-qPCR和hMeDIP-qPCR检测NTDs相关基因的转录水平及DNA羟甲基化修饰在NTDs相关基因中的富集变化。6.构建低叶酸喂养联合甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)诱导NTDs胎鼠模型,利用DNA斑点杂交技术(DNA dot blot)、免疫组化(Immunohistonchemistry,IHC)检测DNA羟甲基化修饰、DNA羟甲基化酶和DNA甲基化酶的变化情况;利用RT-qPCR检测NTDs胎鼠模型中NTDs相关基因的转录水平变化。研究结果:1.RNA-seq结果显示,叶酸缺乏引起mESCs中基因发生显著差异变化,差异表达基因与氧代谢、细胞生长和发育、DNA及组蛋白甲基化通路有关;RT-qPCR结果表明叶酸缺乏引起DNA羟甲基化酶Tet1、Tet2和DNA甲基化酶Dnmt1发生显著上调,DNA羟甲基化酶Tet3、Tdg和DNA甲基化酶Dnmt3a、Dnmt3b发生显著下调。2.hMeDIP-seq和MeDIP-seq结果显示,叶酸缺乏引起mESCs中5hmC和5m C富集水平发生变化,其中5hmC显著富集在刺猬声波(Sonic hedgehog,Shh)信号通路中;hMeDIP-qPCR结果表明叶酸缺乏促进Shh通路相关基因Gli2、Csnk1g3、Hhatl、Smurf1中5hmC富集上调。3.ChIP-seq结果显示,叶酸缺乏促进H3K27ac在mESCs及Shh通路相关基因Gli2、Csnk1g3、Hhatl、Smurf1中富集。4.hMeDIP-seq、MeDIP-seq和H3K27ac-seq综合分析结果显示,叶酸缺乏促进5hmC和H3K27ac在Shh通路相关基因Gli2、Csnk1g3、Hhatl、Smurf1启动子区的富集,并且两者的富集区域存在共定位的情况;RT-qPCR和hMeDIP-qPCR结果显示叶酸缺乏条件下Gli2、Hhatl基因表达及5hmC富集显著增加。叶酸回补可挽救叶酸缺乏引起的Shh通路下游基因Gli2、Hhatl表达水平显著下调并拮抗DNA羟甲基化修饰与Gli2、Hhatl的富集。5.低叶酸喂养联合MTX诱导NTDs胎鼠模型中,NTDs胎鼠脑组织的5hmC水平上调;IHC结果显示,NTDs胎鼠脑组织中DNA羟甲基化酶TET1和DNA甲基化酶DNMT1显著上调,DNA羟甲基化酶TET2、TET3和DNA甲基化酶DNMT3B显著下调;RT-qPCR结果表明NTDs胎鼠脑组织中Shh通路下游基因Gli2、Hhatl表达水平显著上调。研究结论:叶酸缺乏促进H3K27ac协同DNA羟甲基化修饰激活Shh通路及下游基因参与NTDs的发生,叶酸回补可挽救叶酸缺乏引起的Shh通路下游基因Gli2、Hhatl表达水平及5hmC富集水平变化。