研究背景:喜树碱是从喜树中提取分离得到的生物碱,主要通过作用于细胞内的拓扑异构酶I抑制DNA合成以达到抗肿瘤的作用。喜树碱完整的内酯环是抑制拓扑异构酶I的药效基团。喜树碱通过诱导细胞凋亡的形式杀死肿瘤细胞,极易发生多药耐药导致化疗失败。因此,将喜树碱以内酯环形式递送至肿瘤细胞,并能克服肿瘤对喜树碱的耐药,具有重要的研究价值。铁死亡是不同于细胞凋亡的一种程序性细胞死亡形式,在肿瘤治疗中发挥重要作用。铁死亡的本质是细胞内过量的游离铁催化过氧化氢,产生大量的ROS,进而氧化细胞膜上的脂质,形成大量的脂质氢过氧化物。因此,向肿瘤细胞内递送铁离子,有望通过铁死亡途径杀死耐药肿瘤细胞,从而克服肿瘤耐药。多巴胺可以与金属离子配位,在碱性环境下能够进行氧化自聚合反应,形成具有超强细胞黏附特性mediation model的聚多巴胺(Polydopamine,PDA)纳米粒。聚多巴胺纳米粒具有优异的光热转化能力和p H响应性的释放特性。聚多巴胺的网状结构也可以高效负载药物,另外,多巴胺结构上的氨基利于结构修饰,将肿瘤靶向基团叶酸连接在多巴胺上,还能够增强聚多巴胺纳米粒的肿瘤主动靶向特性。三阴性乳腺癌由于难以采用抗体和免疫治疗,化学治疗成为治疗三阴性乳腺癌的主要方法。而传统化疗由于易产生耐药性,协同治疗成为治疗三阴性乳腺癌并克服耐药的有前景的方法。研究目的:选用多巴胺和叶酸修饰的多巴胺为载体材料,通过氧化自聚合反应,制备共同负载CPT和Fe~(3+)的肿瘤主动靶向纳米粒CPT/Fe@PDA-FA。将纳米粒靶向递送至肿瘤部位,实现纳米粒的高效入胞,并在细胞内p H响应刺激下释放CPT和Fe~(3+),利用PDA纳米粒的光热特性,实现基于喜树碱的凋亡、铁死亡与光热三联合肿瘤靶向治疗作用,多途径协同杀死耐药肿瘤细胞。研究方法:1.采用多巴胺与叶酸为原料,通过酰胺化反应,合成叶酸修饰的多巴胺肿瘤靶向材料,经过核磁共振波谱及红外光谱对目标化合物进行表征确证。2.以多巴胺及不同比例的叶酸修饰的多巴胺为原料,通过氧化自聚合反应,并利用多巴胺结构中的酚羟基与Fe~(3+)的配位作用以及聚多巴胺网格结构与喜树碱平面结构的π-π堆积实现Fe~(3+)和CPT的高负载,得到共同负载Fe~(3+)和CPT的肿瘤主动靶向纳米粒CPT/Fe@PDA-FA;采用动态光散射激光粒度仪、高效液相色谱仪、紫外分光光度计、扫描电子显微镜与透射电子显微镜对纳米粒的粒径、多分散指数(PDI)、zeta电位、载CPT量、载铁量、稳定性、形态学及元素分布进行评价。3.CPT/Fe@PDA、CPT/Fe@PDA-FA5、CPT/Fe@PDA-FA10及CPT/Fe@PDA-FA20分别与4T_1-Luc细胞共孵育后,通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒的摄取量,筛选最优纳米粒。采用红外热成像仪考察CPT/Fe@PDA-FA10纳米粒的光热转化性能;考察CPT/Fe@PDA-FA10纳米粒的p H响应性释药特性、体外药物释放动力学及溶血作用。4.采用MTT实验、细胞克隆形成实验及活死细胞染色实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的增殖活性。5.采用MTT实验、ROS及LPO染色后激光共聚焦实验、GSH及MDA含量测定实验、生物透射电镜及Western blot等实验,观察细胞增殖活性、检测ROS、LPO、GSH及MDA含量、观察线粒体形态及观察铁死亡相关蛋白(GPX4和SLC7A11)的表达等,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的铁死亡活性。6.采用凋亡染色流式实验及Western blot实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的凋亡活性。7.采用MTT竞争性生长抑制实验及激光共聚焦竞diABZI STING agonist说明书争性摄取实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的肿瘤主动靶向作用及细胞摄取机制。8.通过原位注射4T1-Luc/CPT耐药细胞至乳腺,构建原位耐药三阴性乳腺癌裸鼠模型;通过红外热成像仪观察CPT/Fe@PDA-FA10在荷瘤裸鼠体内的光热转化性能。9.通过游标卡尺测量原位耐药三阴性乳腺癌的体积,小动物活体成像系统拍摄裸鼠肿瘤的荧光强度,考察CPT/Fe@PDA-FA10对裸鼠原位耐药三阴性乳腺癌生长的抑制作用。10.通过肿瘤组织的H&E染色、TUNEL染色、ROS染色、LPO染色、Ki67染色、Western blot实验、MDA和GSH的含量检测及Caspase 3、Bcl-2、GPX4和SLC7A11免疫荧光染色实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10抗原位耐药三阴性乳腺癌的机制。11.通过称量荷瘤裸鼠体质量,检测裸鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性,以及血清尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)的含量,裸鼠的心、肝、脾、肺及肾组织的H&E染色,考察CPT/Fe@PDA-FA10对裸鼠的毒性。研究结果:1.合成了叶酸修饰的多巴胺肿瘤靶向材料,核磁共振氢谱及红外光谱确证为目标化合物。2.CPT/Fe@PDA、CPT/Fe@PDA-FA5、CPT/Fe@PDA-FA10及CPT/Fe@PDA-FA20纳米粒的平均粒径在200-400 nmhttps://www.selleck.cn/products/MLN8237.html之间,多分散指数(PDI)小于0.2。CPT/Fe@PDA-FA纳米粒的载铁量在10%左右,包封率在50%左右,载喜树碱量在12%左右,包封率在38%左右。CPT/Fe@PDA、CPT/Fe@PDA-FA5、CPT/Fe@PDA-FA10及CPT/Fe@PDA-FA20纳米粒在4℃持续放置28天保持稳定。3.激光共聚焦实验观测结果显示10%靶头修饰的纳米粒CPT/Fe@PDA-FA10的细胞摄取效果最好。透射电镜和扫描电镜测定结果显示CPT/Fe@PDA-FA10纳米粒为圆球形,形状规则,均一性好,含有C、N、O和Fe元素。红外热成像仪观察结果显示CPT/Fe@PDA-FA10纳米粒具有照射时间、激光功率及纳米粒浓度依赖的光热转化性能。药物释放实验表明CPT/Fe@PDA-FA10具有弱酸敏感性的药物释放能力,释药行为满足双指数双相动力学方程。溶血性实验结果显示CPT/Fe@PDA-FA10不会产生溶血现象。4.所构建的4T1-Luc/CPT耐药细胞的IC_(50)为21483 nmol/L,耐药指数(RI)为144,达到成功构建耐药细胞的标准。MTT实验、克隆形成实验及活死细胞染色实验结果显示CPT/Fe@PDA-FA10+Laser可以通过凋亡、铁死亡及光热治疗发挥抗肿瘤作用,并对耐药的肿瘤细胞表现出良好的抗肿瘤效果。5.铁死亡抑制剂Fer-1或DFO的加入均能够抑制CPT/Fe@PDA-FA10的抗肿瘤效果。CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组的ROS、LPO及MDA含量明显升高,GSH含量明显降低,线粒体颜色加深,双层膜密度增加,Western blot实验观察的SLC7A11蛋白和GPX4蛋白的表达量显著性降低。上述实验结果表明CPT/Fe@PDA-FA10可以以铁死亡途径发挥抗肿瘤作用。6.CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组的流式凋亡染色比例最高,Western blot实验观察的Caspase 3蛋白表达量显著性增高,Bcl-2蛋白的表达量显著性降低,上述实验结果表明CPT/Fe@PDA-FA10可以以凋亡途径发挥抗肿瘤作用。7.竞争性抑制剂FA的加入未改变无靶头纳米粒CPT/Fe@PDA对4T1-Luc/CPT耐药细胞的抑制活性和细胞摄取量,但可显著性降低CPT/Fe@PDA-FA10对4T1-Luc/CPT耐药细胞的抗肿瘤效果和摄取量。上述实验结果表明CPT/Fe@PDA-FA10具有肿瘤细胞主动靶向特性。而且,网格蛋白途径抑制剂氯丙嗪及小窝途径抑制剂金雀异黄酮的加入可显著减少细胞对CPT/Fe@PDA-FA10的摄取量,表明CPT/Fe@PDA-FA10主要通过网格蛋白介导途径及小窝介导途径被4T1-Luc/CPT耐药细胞摄取。8.小动物活体成像结果显示成功构建了原位耐药三阴性乳腺癌裸鼠模型。照射激光后,CPT/Fe@PDA-FA10组的温度显著性升高,显示良好的光热转化性能。肿瘤体积与荧光强度变化趋势结果表明,与其它治疗组相比,CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组可通过凋亡、铁死亡及光热协同治疗方式,展示出更好的体内抗肿瘤作用。9.乳腺癌组织H&E染色结果进一步显示,与其它治疗组相比,CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组肿瘤组织的癌细胞数目减少,异形细胞核数目也减少。CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组肿瘤组织中的ROS、LPO及MDA的含量显著性升高,而GSH的含量显著性降低,免疫荧光染色实验及Western blot实验观察到的GPX4及SLC7A11的表达量显著性降低,这些实验结果共同表明CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组能够通过细胞铁死亡途径有效抑制原位耐药三阴性乳腺癌。10.CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组肿瘤组织中的TUNEL和Caspase 3染色的阳性细胞数目显著增多,Bcl-2染色的阳性细胞数目显著性减少,Western blot实验观察的CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组乳腺癌组织中凋亡相关蛋白Caspase 3表达量显著增多,Bcl-2表达量显著减少。上述实验结果表明CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组能够通过细胞凋亡途径有效抑制原位耐药三阴性乳腺癌。11.CPT/Fe@PDA-FA10+Laser组的裸鼠体质量无明显变化,表明CPT/Fe@PDA-FA10+Laser治疗时无全身毒性。各治疗组的裸鼠的血清中ALT和AST的活性,以及BUN和CREA的含量均在正常值范围内,表明各治疗组对荷瘤裸鼠肝肾功能未造成损伤。各治疗组的荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺及肾组织的H&E染色未观察到明显的形态变化,表明各治疗组均未对荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺及肾组织造成损伤。研究结论:以多巴胺和叶酸修饰的多巴胺作为载体,构建了基于喜树碱的凋亡、铁死亡与光热三联合肿瘤靶向纳米治疗系统CPT/Fe@PDA-FA。优化所得CPT/Fe@PDA-FA10能有效负载CPT和Fe~(3+),具有良好的肿瘤靶向能力、酸敏感的药物释放特性、优异的光热转换性能和体内外抗肿瘤效果。体外和体内抗肿瘤研究表明,CPT/Fe@PDA-FA10可在肿瘤组织有效聚集并被主动地摄取到肿瘤细胞中,在激光照射下通过凋亡、铁死亡与光热三联合方式杀死耐药的三阴性乳腺癌细胞,而且对主要组织器官无明显的毒副作用。该策略为构建基于中药单体喜树碱的协同治疗耐药三阴性乳腺癌提供了新的思路,为中药活性成分喜树碱的临床应用和新制剂研究提供了实验支持。