Selenium(Se)被认为是一种重要的非金属微量元素,它对于动物的健康、免疫系统的正常运转以及生殖能力的提升都起到了至关重要的作用。动物体摄入硒后主要以合成硒蛋白的方式发挥作用,其中谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)是谷胱甘肽家族重要的抗氧化酶之一,也是谷胱甘肽家族唯一的一种分泌酶。Gpx3主要由肾脏合成并随血液到靶器官发挥作用,已证明其在抗氧化、抗炎、抗癌和抗肥胖方面具有重要作用。巨噬细胞胞外陷阱(METs)是一种新发现的自杀式的巨噬细胞免疫机制,通过释放含有MPO、NE和cit H3等的DNA网状结构发挥作用,并且能够损伤上皮细胞,进而在纤维化进程中发挥作用。除肾脏外,肺脏也是Gpx3表达较丰富的组织,缺硒能够显著降低肺脏中Gpx3的表达,然而缺硒是否能够通过硒蛋白调控METs的释放以及在肺脏纤维化中的作用机制还不明确。因此,本试验以1日龄AA肉鸡为研究对象,分别饲喂硒含量为0.278mg/kg的正常日粮和硒含量为0.039mg/kg的低硒日粮,饲养42天后获得缺硒肉鸡模型。此外,分离鸡胚原代Ⅱ型肺泡上皮(AEC-Ⅱ)细胞,并构建Gpx3敲低的AEC-Ⅱ细胞模型或AEC-Ⅱ细胞和鸡巨噬细胞(HD11)的体外共培养模型。通过H&E染色、天狼星红染色、Masson三色染色、免疫荧光染色、抗氧化指标检测、q RT-PCR、Western Blot、扫描电子显微镜、Hcechst-Sytox Green染色、ER-Tracker Red-Fluo-4AM内质网钙染色、DCFH-DA探针法等方法,检测了肉鸡肺脏组织的病理学变化、25种硒蛋白、趋化因子、炎性因子的表达,以及氧化应激水平、纤维化程度和METs释放情况,旨在明确硒缺乏对肉鸡肺脏肺纤维化的影响、METs与缺硒性肺纤维化之间的关系以及Gpx3在其中发挥作用的分子机制。主要研究结果如下:(1)组织硒含量检测结果显示,硒缺乏组肉鸡肺脏组织中硒含量显著降低(p<0.001)。组织形态学观察结果显示相比于对照组,硒缺乏组肺脏组织结构混乱,实变明显,肺泡壁、支气管壁和血管壁显著增厚,网状结构的肺泡被破坏,且有大量炎性细胞和红细胞渗出。Masson染色结果显示硒缺乏组肺脏组织肺泡损伤严重,部分组织肺泡丢失实变,细支气管壁和血管壁增厚,血管和细支气管周围有大量蓝色的胶原纤维沉积甚至部分区域有纤维束形成。天狼星红染色结果也显示硒缺乏组肺泡分布不均伴有部分肺泡壁破损,肺小叶间隙增宽,可见部分实变区域,血管、细支气管和肺小叶间有大量红染的胶原纤维束。上述结果表明硒缺乏促进了肉鸡肺脏组织损伤,并且能够导致肺脏发生纤维化。(2)肉鸡肺脏25种硒蛋白m RNA水平的检测结果显示,除Dio2和Dio3的m RNA水平无显著变化外(p>0.05),硒缺乏组其余硒蛋白均显著降低,其中Gpx3和Sel I变化最显著(p<0.001),提示Gpx3可能在缺硒性肺纤维化过程中发挥重要作用。(3)组织氧化应激检测结果显示,硒缺乏组肉鸡肺脏组织中氧化产物H_2O_2、MDA含量增加,抗氧化酶CAT和T-SOD活性减弱,组织总抗氧化能力(T-AOC)降低。抗氧化酶表达水平检测结果发现硒缺乏组抗氧化酶HO-1、NQO1、SOD1、SOD2、SOD3和CAT表达显著降低(p<0.05)。体外敲低AEC-Ⅱ细胞中的Gpx3后,ROS生成水平显著增多并且能够被NAC明显抑制。上述结果表明硒缺乏导致的Gpx3表达降低引起肉鸡肺脏组织发生氧化应激。(4)趋化因子检测结果显示,硒缺乏组肉鸡肺脏组织中趋化因子CCL1、CCL4、CCL5、CCL17、CXCL12、CXCL13、CXCL14表达显著升高(p<0.05)。体外敲低AEC-Ⅱ细胞中的Gpx3后,趋化因子CCL1、CCL4、CCL5、CCL17、CXCL12、CXCL13、CXCL14的转录水平显著高于si NC组(p<0.05)。上述结果表明,缺硒导致的Gpx3表达降低能够促进巨噬细胞向损伤的肺组织募集。(5)巨噬细胞胞外陷阱检测结果表明,硒缺乏组肺脏组织中METs主要标志物MPO、cit H3和巨噬细胞标记物CD68的表达均显著增多(p<0.05),METs形成相关蛋白PKCα、PKCβ、PKCε、PLCγ、MPO、NE和cit H3表达也显著升高(p<0.05)。Hochest-Sytox Green染色发现缺硒培养基培养的HD11细胞METs的形成增多。si Gpx3-AEC-Ⅱ细胞与HD11细胞共培养体系中,HD11细胞METs的释放显著增多(p<0.05),METs形成相关蛋白PKCα、PKCβ、PKCε、PLCγ、MPO、NE和cit H3表达也显著升高(p<0.05),内质网钙离子水平显著降低(p<0.05),ROS生成明显增多(p<0.05)。当加入ROS抑制剂NAC后不但抑制了共培养体系中ROS的生成,还有效抑制了METs的释放。上述结果表明缺硒导致的Gpx3表达降低引起肺组织发生氧化应激进而促进METs释放。(6)炎症反应检测结果显示,硒缺乏组肉鸡肺脏组织促炎因子COX-2、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和i NOS表达显著高于对照组(p<0.05),IFN-γ表达显著低于对照组(p<0.05),且免疫荧光结果显示硒缺乏组肺脏组织IL-1β和TNF-α表达显著升高(p<0.001)。体外敲低AEC-Ⅱ细胞中的Gpx3后,细胞内促炎因子COX-2、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和i NOS表达显著升高,IFN-γ表达显著降低。PMA刺激的HD11细胞与AEC-Ⅱ细胞共培养后,同样在AEC-Ⅱ细胞中将测到了上述促炎因子表达的显著升高(p<0.05)。以上结果表明硒缺乏导致的Gpx3表达降低不但能够直接引起肺脏的炎症反应,还能通过促进METs的生成促进肺脏的炎症反应。(7)组织纤维化检测结果显示,硒缺乏组肉鸡肺脏组织纤维化相关基因MMP2、MMP9、TIMP2、COL1、COL3、FN和Vimentin的表达水平显著升高(p<0.05)。上皮标志基因E-cadherin和间质标志基因N-cadherin的免疫荧光检测结果显示,硒缺乏组肺脏组织E-cadherin表达降低、N-cadherin表达升高。硒缺乏组TGF-β/Smad通路相关基因TGF-β、Smad2、Smad3和间质标志基因N-cadherin、ACTA2的表达显著升高,上皮标志基因E-3-Methyladeninecadherin、ZO-1显著下降(p<0.05)。体外敲低AEC-Ⅱ细胞中的Gpx3后,细胞中TGF-β/Smad通路相关基因和间质标志基因的表达显著升高,上皮标志基因的表达显著下降(p<0.05)。PMA刺激的HD11细胞与AEC-Ⅱ细胞共培养后,METs显著刺激AEC-Ⅱ细胞中TGF-β/Smad通路相关基因和间质标志基因的表Bioactive cement达,同时显著抑制了上皮标志基因的表达(p<0.05)。上述结果表明硒缺乏导致的Gpx3表达降低不但能够直接促进AEC-Ⅱ细胞发生EMT,还能够通过促进METs释放进而促进AEC-Ⅱ细胞发生EMT,最终引起肺脏纤维化。综上所述,硒缺乏导致肉鸡肺脏组织纤维化,同时Gpx3表达降低,诱发氧化应激和炎症反应,促进趋化因子释放和巨噬细胞向肺脏的募集,促进METs的释放进而诱导EMT,上述结果表明,缺硒通过Gpx3/ROS轴调控METs诱发EMT引起鸡肺纤维化。本研究首次探讨了Gpx3对METsPLX5622化学结构释放的调控机制和METs在肺纤维化中的作用,并为肺纤维化的预防和治疗提供新的思路,同时为进一步探讨Gpx3的生物学功能提供参考。