研究背景:肝癌是目前全球范围内最常见的致命性恶性肿瘤,患者经常在疾病晚期被诊断,临床预后较差。目前针对肝癌的治疗方法主要包括肝脏移植、放射疗法、化学疗法及免疫疗法。肝癌的起病机制较为复杂,早期防治肝癌是改善疾病预后的重点手段。与正常细胞相比,肝癌细胞具有较强的增殖和凋亡逃避能力,因此可以从调控肝癌细胞增殖和凋亡的角度影响疾病的发生和发展。长非编码RNA(longnon-coding RNA)是一类新型非编码RNA,长度大于200个核苷酸。在转录、翻译和表观遗传水平等方面调节癌细胞的分子过程,参与作用癌细胞侵袭、转移、耐药性发生、增殖和凋亡等。HOTAIR(HOX转录反义RNA)是一种十分重要的致癌lncRNA,位于12q13.13号染色体上的HOXC11和HOXC12基因簇之间。HOTAIR通过调控信号通路、激活EMT、抑制磷酸化使自噬失活、影响增殖凋亡进程等方面在癌症中发挥作用,成为开发肝癌靶向治疗方法的靶点之一。microRNA(miRNA)是一种小的非编码内源性RNA,长度约为20-24个核苷酸。在大多数癌症中,miRNA通过转录后基因沉默控制多种调控途径。研究表明,miRNA可充当抑癌或者致癌基因,其表达水平失调调控癌症的发生发展。近年来,关于miRNA在癌症预后诊断与治疗方面的研究达到临床开发程度,例如 miR-34a、miR-122 等。信号素家族(Semaphorins)存在于生物体内,大量研究表明信号素是多种生物Aurora Kinase抑制剂过程的重要调节因子,在癌症中异常表达。Semaphorins由20多个基因组成,分为七个亚家族,所有基因都具有一个约500个氨基酸组成的结构域SEMA,通过多种机制促进或者抑制癌症发生发展。其中信号素蛋白6A(SEMA6A)参与多种生物学进程,在神经系统发育、血管生成、癌细胞凋亡等过程中发挥重要作用。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinases)信号通路是癌症患者中最常见的失调的信号通路之一,PI3K/Akt信号通路参与细胞转移、代谢、增殖凋亡等多种过程。目前,靶向PI3K/Akt信号通路主要激酶的小分子抑制剂已成为癌症靶向治疗的主要趋势。本研究根据相关文献和前期结果推测,探讨lncRNA-HOTAIR/miR-144-5p/SEMA6A通路是否通过调控PI3K/Akt信号通路活性进而影响肝癌细胞的增殖及凋亡。目的:前期实验结果证明HOTAIR通过PRC2途径负调节miR-144-5p;测序结果表明提高HOTAIR表达水平时,SEMA6A呈现差异表达。通过探讨并阐明HOTAIR/miR-144-5p/SEMA6A通路调控PI3K/Akt通路活性继而影响肝癌细胞增殖凋亡的机制,对肝癌的靶向治疗研究起到推进作用。实验方法:1.通过提取转染过表达载体的细胞总RNA进行测序,将测序结果运用转录组学联合分析出差异表达的miRNA和mRNA。通过GO、KEGG富集分析构建HOTAIR-miRNA-mRNA互作网络,确定网络相关分子。2.通过转录组测序、qPCR筛选差异表达的基因。3.Western Blot、qPCR 实验检测 HOTAIR、miR-144-5p 与 SEMA6A 之间调控关系。4.双荧光素酶实验验证miR-144-5p调控SEMA6A表达的分子机制。5.MTT、克隆形成、EdU细胞增殖实验检测HOTAIR、miR-144-5p在肝癌细胞HepG2和SNU-387中对增殖能力的影响。6.流式细胞术、Western Blot检测相关凋亡蛋白、免疫荧光实验检测HOTAIR、miR-144-5p对凋亡的影响。7.Western blot实验检测HOTAIR和miR-144-5p对PI3K/Akt通路相关分子的影响。实验结果:1.测序结果表明,HOTAIR正向调控SEMA6A。2.GEPIA数据库结果显示,SEMA6A表达水平高时,肝癌患者生存率降低;表达水平低时,肝癌患者生存率升高。3.qPCR、Western Blot 结果表明,过表达textual research on materiamedica HOTAIR 后点击此处 HepG2 和 SNU-387 细胞中SEMA6A mRNA、蛋白表达水平升高,敲低HOTAIR后SEMA6A水平降低。4.qPCR、Western Blot 结果表明,转染 miR-144-5p 类似物(mimic)后 SEMA6A mRNA、蛋白表达水平降低,转染miR-144-5p抑制剂(inhibitor)后SEMA6A表达水平升高。5.荧光素酶实验结果表明,miR-144-5p与SEMA6A的3′-UTR直接结合。6.MTT、克隆形成、EdU细胞增殖实验结果表明,敲低HOTAIR、转染miR-144-5p类似物后细胞增殖能力下降;过表达HOTAIR、转染miR-144-5p抑制剂后细胞增殖能力上升。7.流式细胞术、Western Blot、免疫荧光结果证明敲低HOTAIR和转染miR-144-5p类似物后凋亡率上升,c-Caspase3、BAX表达水平上升,Bcl-2表达水平降低,Bax/Bcl-2比值增加,胞核固缩,染色质凝集;过表达HOTAIR和转染miR-144-5p抑制剂后凋亡率降低,BAX、c-Caspase3表达水平降低,Bcl-2表达水平升高,B ax/B cl-2比值减小,胞核形态无明显变化。8.Western Blot 结果证明敲低 HOTAIR、转染 miR-144-5p 类似物后 p-PI3K、p-Akt表达量降低,p-PI3K/P13K和p-Akt/Akt的比率降低;过表达HOTAIR、转染 miR-144-5p 抑制剂后,p-PI3K、p-Akt 表达量增加,p-PI3K/P13K 和 p-Akt/Akt的比率升高。结论:1.HOTAIR 正向调控 SEMA6A,miR-144-5p 通过与 SEMA6A 的 3′-UTR 端直接结合的方式负调控SEMA6A。2.HOTAIR靶向miR-144-5p/SEMA6A轴影响肝癌细胞增殖、凋亡。3.HOTAIR/miR-144-5p/SEMA6A信号通路通过调控PI3K/Akt信号通路活性影响肝癌细胞增殖、凋亡。