CRISPR/Cas系统是原核生物的天然免疫系统,目前已广泛应用于基因编辑、表达调控以及生物传感等领域。相较于常规聚合酶链式反应(PCR),等温核酸扩增技术可在恒定温度下完成扩BYL719研究购买增反应,已在基础研究和临床诊断中显示出良好的应用潜力,但仍存在特异性低、设计复杂及适用范围小等缺点。可将CRISPR/Cas系统与等温核酸扩增的技术优势相结合,开发核酸分析检测新方法。本课题组已建立的Cas9n蛋白偶联DNA聚合酶的等温核酸扩增方法(Cas9nAR),具有灵敏度高、特异性好以及可定量检测等优势,但由于来自化脓性链球菌SpCas9n蛋白分子量大且解离速度慢,扩增效率有待进一步提高。基于此,本论文对该方法优化设计以提高Cas9nAR反应扩增效率,缩短反应时间,提升应用潜力。主要研究内容如下:第一,基于Cas9n蛋白的优化以提高反应效率。选取来自金黄色葡萄球菌SaCas9及SpCas9蛋白变体应用于本扩增方法,通过比较嵌合染料SYBRGreenI与产物结合产生的实时荧光信号强弱,比较不同变体蛋白的扩增效率。结果显示基于SaCas9n的Cas9nAR扩增方案在30 min的扩增效率相当于基于SpCas9n的扩增方案在60 min扩增效率的9MCC950使用方法5%,能够显著提高反应效率,以及具有特异性强、普适性广等特点。基于此优化设计,对单核细胞增生李斯特氏菌等致病菌的特征基因进行检测,可在30min内检测到单拷贝靶标基因。证明选择体积更小的SaCas9n蛋白偶联DNA聚合酶的等温扩增反应,能缩短反应时间,提升整体扩增效率。第二,基于可视化分Herbal Medication析以优化反应输出信号。为实现对反应结果的快速判读,通过在体系中分别加入pH指示剂、HNB与钙黄绿素,对比反应前后的颜色变化。结果表明通过HNB与SYBR Green 指示剂应用于等温扩增反应,可肉眼判读反应结果,同时具有较高灵敏度。第三,基于SaCas9n偶联DNA聚合酶的等温扩增方法对宫颈癌细胞基因组DNA进行特征基因的检测与分型。HPV-DNA检测作为宫颈癌筛查的首选方法,可有效地提高癌前病变筛查准确性,因此我们利用本方法对HPV16与HPV18的L1基因与E6/E7基因进行特异性检测。设计高特异性引物与sgRNA搭建分型检测平台并检测靶基因,该方法可在30 min内完成检测,且不同分型间无交叉反应,在不同亚型HPV混合样本中成功检测到0.5%微量靶基因。利用SaCas9n偶联DNA聚合酶的等温扩增方法对粗提取基因组样本进行等温核酸检测,粗提取样本的检测效率约为试剂盒提取样本检测效率的81.5%,证明该方法可兼容粗提取样本,缩短样本预处理时间,降低检测成本,证明其具有较高的实际应用潜力。