脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁成分,大肠杆菌(E.coli)及其LPS侵袭是诱发奶牛乳腺炎的主要原因之一。LPS引起的乳腺持续性感染使得乳汁中乳脂、乳蛋白组成发生变化,影响牛奶质量。奶牛乳腺上皮细胞是乳汁Anti-CD22 recombinant immunotoxin合成场所,也是乳腺先天免疫屏障的重要组成,在抵御病原菌入侵方面发挥重要作用。LPS刺激乳腺上皮细胞可以激活炎症信号通路,促进炎症因子释放,LPS及其诱导产生的细胞因子IL-6也是细胞铁死亡的新型诱导剂。LPS是重要的病原体相关分子模式,可被细胞表面的模式识别受体TLR4识别,膜蛋白CD36是其辅助受体。FAK/m TORC1是细胞重要的信号转导通路,可以介导多种配体信号激活细胞,包括LPS诱导的炎症因子表达。目前,膜受体TLR4-CD36如何介导LPS信号激活FAK/m TORC1通路尚不清楚,LPS及炎症因子IL-6是否可以诱导奶牛乳腺上皮细胞铁死亡,进而影响乳脂、乳蛋白合成也有待阐明。本研究以奶牛乳腺上皮细胞为模型,利用大肠杆菌LPS处理细胞,建立体外炎症模型,进而通过分子细胞生物学技术研究TLR4-CD36复合体偶联FAK/m TORC1信号通路激发炎症反应的分子机制。同时探究LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞铁死亡进而影响乳脂、乳蛋白合成的机制。具体研究内容包括:1)在优化LPS处理剂量和处理时间基础上,建立LPS体外诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,通过CCK8检测细胞增殖、RT-q PCR结合ELISA检测炎症因子表达;2)利用anti-TLR4和anti-CD36封闭膜受体TLR4和CD36,通过RT-q PCR和ELISA检测LPS处理细胞后炎症因子表达,Western Blot检测FAK/m TORC1信号通路和炎症相关转录因子NF-κB活性,确认膜受体TLR4-CD36介导LPS信号激活FAK/m TORC1信号通路,进而引起细胞炎症反应;3)通过免疫共沉淀结合酵母双杂交实验检测TLR4、CD36、Fyn、Lyn、FAK蛋白分子间的相互作用关系,确定TLR4-CD36复合体与FAK之间的连接分子;4)透射电子显微镜观察,胞内线粒体、亚铁离子以及脂质过氧化物荧光染色,RT-q PCR以及Western Blot分别检测LPS、IL-6处理细胞后线粒体形态变化和线粒体损伤情况,铁离子累积,脂质过氧化物含量,丙二醛(MDA)和谷胱甘FG-4592分子量肽(GSH)含量,铁死亡关键基因acsl4和gpx4的m RNA丰度和蛋白表达情JQ1说明书况,确认LPS、IL-6处理可以诱导细胞铁死亡;5)通过脂滴BODIPY~(?493/503)染色、RT-q PCR、ELISA以及Western Blot分别检测LPS、IL-6处理细胞后脂滴累积情况,乳蛋白分泌情况和乳脂、乳蛋白合成相关基因表达情况,确认LPS、IL-6处理导致奶牛乳腺上皮细胞乳脂、乳蛋白合成减少。结果表明:1)LPS处理奶牛乳腺上皮细胞,细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌量增加,0.5μg/m L的LPS处理细胞24 h,细胞炎症因子表达量显著升高(p<0.01),且较为稳定;2)抗体封闭TLR4、CD36以及共同封闭TLR4和CD36,炎症因子基因tnf-α、il-1β、il-6和il-8的m RNA丰度下调(p<0.01),炎症因子释放量显著减少(p<0.01),FAK/m TORC1信号通路和NF-κB活性降低。表明膜受体TLR4-CD36介导了LPS信号激活FAK/m TORC1通路,激发细胞炎症反应;3)免疫共沉淀显示TLR4、CD36、Fyn、Lyn和FAK之间具有相互作用关系。酵母双杂交实验进一步确认TLR4-CD36,TLR4-Fyn,CD36-Fyn,Fyn-FAK具有较强的直接相互作用关系,而TLR4-Lyn,CD36-Lyn,Lyn-FAK之间的相互作用关系较弱,Fyn是TLR4-CD36与FAK之间的接头蛋白,构成TLR4-CD36/Fyn/FAK/m TORC1通路;4)LPS、IL-6处理奶牛乳腺上皮细胞,线粒体受损,脂质过氧化物增多,MDA含量显著升高(p<0.01),GSH含量显著降低(p<0.01),铁离子积累(p<0.01),铁死亡关键基因acsl4的m RNA和蛋白水平显著升高(p<0.01),gpx4的m RNA和蛋白水平显著下降(p<0.01),表明LPS、IL-6诱导细胞铁死亡;5)LPS、IL-6处理奶牛乳腺上皮细胞,均可以导致脂滴合成减少,乳脂合成相关基因gpat4、acsl1、lipin1、scd的m RNA丰度显著下降(p<0.01),蛋白水平显著降低(p<0.01)。3种乳蛋白合成相关基因α-la、β-lg、csn2的m RNA丰度显著下降(p<0.05),蛋白分泌水平显著降低(p<0.05)。表明LPS、IL-6均可减少细胞乳脂、乳蛋白的合成。综上所述,LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞引起的细胞炎症反应由膜受体TLR4-CD36介导,通过Fyn偶联FAK/m TORC1通路,激活NF-κB,促进细胞炎症因子表达。LPS、IL-6均可诱导奶牛乳腺上皮细胞铁死亡,通过抑制乳脂、乳蛋白合成相关基因表达,减少乳脂、乳蛋白合成,二者的作用可能存在级联效应。研究结果为阐明LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应、铁死亡和乳脂、乳蛋白合成减少之间的联系和调控机制提供了基础数据和新思路,丰富免疫学知识,为奶牛乳腺炎的预防和治疗提供科学依据。