第一部分点击化学表面修饰M2型巨噬细胞来源外泌体治疗小鼠脊髓损伤的相关研究研究目的:脊髓损伤是中枢神经系统的破坏性疾病,可导致患者损伤平面以下渐进性的神经组织丢失以及感觉和运动功能障碍。目前,脊髓损伤暂无有效的治疗手段,不仅严重影响了患者的生活质量,还给患者家庭以及社会造成了沉重的负担。外泌体是细胞分泌的一种胞外囊泡,因其丰富的生物学功能而受到广泛关注。其中,M2型巨噬细胞外泌体已被证明具有炎症调节功能,具有治疗脊髓损伤的巨大潜力。本部分研究拟通过表面修饰的方法,赋予M2型巨噬细胞外泌体神经保护特性,制备抗炎/促神经再生双功能外泌体,以治疗脊髓损伤。研究方法:使用超速离心法提取M2型巨噬细胞外泌体,再利用点击化学的方法将IKVAV多肽接枝于外泌体表面,得到双功能外泌体MEXI。通过透射电镜、粒径分析、WB等方法对MEXI进行鉴定;利用UV-Vis、FT-IR、zeta电位、荧光共定位等手段对MEXI进行表征。体外,首先进行外泌体吞噬实验,以检测MEXI的生物相容性;其次,诱导RAW264.7单核巨噬细胞成为M1型巨噬细胞,使用MEXI刺激M1型巨噬细胞,通过免疫荧光、流式细胞术、qRTBiobehavioral sciences-PCR等实验技术评估MEXI对于巨噬细胞表型的调控能力;提取神经干细胞,使用MEXI刺激神经干细胞,使用CCK-8评估MEXI对神经干细胞增殖行为的影响;通过免疫荧光、qRT-PCR等实验技术评估MEXI对于神经干细胞分化的促进作用。建立小鼠创伤性脊髓损伤模型,通过尾静脉注射MEXI。首先,通过小动物活体成像技术观察MEXI在体内的去向,评估MEXI的炎症靶向性;其次,通过BMS评分、小鼠足迹分析、游泳实验以及小鼠电生理检测评估MEXI对于脊髓损伤小鼠运动功能的治疗作用;随后,进行组织学评估,利用免疫荧光染色观察损伤局部区域巨噬细胞的浸润情况、巨噬细胞的表型、神经干细胞的分化以及神经组织的再生,综合评价MEXI的治疗效果;最后,通过H&E染色观察经过治疗的小鼠主要器官的组织结构,并使用血液学分析判断小鼠的肝肾功能,以评估MEXI的生物安全性。研究结果:成功制备MEXI双功能外泌体,且MEXI性质稳定。细胞吞噬实验显示MEXI可成功被RAW264.7单核巨噬细胞吸收。CD206与iNOS免疫荧光染色以及流式细胞术共同说明MEXI能够促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。qRT-PCR实验证明MEXI可下调验证相关基因如iNOS,IL-1β,IL-6与TNF-α等。另外,MEXI展现出了对于神经再生的积极作用。CCK-8实验证明MEXI可在24h的作用时间下促进神经干细胞的增殖;GFAP、MAP2及TUJ1免疫荧光染色证明MEXI可抑制神经干细胞向星形胶质细胞分化,而促进神经干细胞向神经元分化;qRT-PCR实验同样证明了这一结论;GAP43免疫荧光染色则说明MEXI可促进轴突生长。动物实验当中,MEXI在脊髓损伤小鼠体内展现出了良好的炎症靶向性,在损伤部位富集约两周时间。经MEXI治疗的脊髓损伤小鼠,BMS及LSS评分显著提高,足迹分析及神经电生理检测也证明其运动功能得到明显改善。在对脊髓损伤小鼠的脊髓组织进行组织学分析之后,我们发现MEXI可抑制损伤区域的巨噬细胞浸润,同时促进局部M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。组织切片NeuN及TUJ1免疫荧光染色证明MEXI可促进损伤局部神经干细胞向神经元分化,NF-200及MBP免疫荧光染色则证明MEXI可帮助损伤区域神经纤维及髓鞘再生。另外,经MEXI治疗后,小鼠主要器官未产生病变,肝肾功能也无异常,其生物安全性也得到了验证。研究结论:MEXI在细胞与动物实验中均表现出了良好的调控炎症反应与促进神经再生的能力,为脊髓损伤的治疗提供了新的方法。第二部分 负载褪黑素预处理神经干细胞外泌体的水凝胶微球治疗小鼠脊髓损伤的相关研究研究目的:研究褪黑素预处理对大鼠神经干细胞增殖行为以及外泌体产量、质量的影响。制备负载褪黑素预处理神经干细胞分泌的外泌体(MNEVs)的GelMA水凝胶微球递送系统MNEVs@GM,以实现生物活性外泌体在损伤区域的缓释。对MNEVs@GM进行表征,通过一系列体外、体内动物实验评估MNEVs@GM对炎症反应的调控,以及对脊髓损伤后神经再生的作用,为脊髓损伤的治疗提供新的方法以及理论依据。研究方法:通过CCK-8实验、透射电镜及CD63免疫荧光染色等方法研究褪黑素预处理对大鼠神经干细胞增殖行为以及外泌体产量的影响。使用超速离心法提取经过褪黑素预处理的神经干细胞所分泌的外泌体(MNEVs),通过透射电镜、粒径分析、WB等方法对MNEVs进行鉴定,再采用微流控技术制备包裹MNEVs的GelMA水凝胶微球递送系统MNEVs@GM。通过扫描电镜观察MNEVs@GM的表面形貌,并研究MNEVs@GM的机械性能、降解行为,观察MNEVs在水凝胶微球之内的分布以及它的释放行为。体外,首先进行外泌体吞噬实验,以检测MNEVs@GM所释放的外泌体是否可以被RAW264.7及大鼠神经干细胞吞噬;使用Transwell系统进行MNEVs@GM与神经干细胞的共培养,应用CCK-8实验评估MNEVs@GM对神经干细胞增殖行为的影响;通过免疫荧光、qRT-PCR等实验技术评估MNEVs@GM对于神经干细胞分化的促进作用;诱导RAW264.7单核巨噬细胞成为M1型巨噬细胞,使用MNEVs@GM刺激M1型巨噬细胞,通过免疫荧光、流式细胞术、qRT-PCR等实验技术评估MNEVs@GM对于巨噬细胞表型的调控能力。建立小鼠创伤性脊髓损伤模型,原位注射MNEVs@GM。首先,通过小动物活体成像技术观察MNEVs在体内的释放与代谢行为;其次,通过BMS评分、游泳实验以及小鼠电生理检测评估MNEVs@GM对于脊髓损伤小鼠运动功能的治疗作用;随后,进行组织学评selleck激酶抑制剂估,利用免疫荧光染色观察损伤局部区域巨噬细胞的浸润情况、巨噬细胞的表型以及神经组织的再生,综合评价MNEVs@GM的治疗效果;确认细节最后,通过H&E染色观察经过治疗的小鼠主要器官的组织结构,并使用血液学分析判断小鼠的肝肾功能,以评估MNEVs@GM的生物安全性。结果:我们发现褪黑素预处理能够促进大鼠神经干细胞的增殖以及外泌体的分泌。随后,使用微流控技术成功制备MNEVs@GM水凝胶微球递送系统,MNEVs@GM呈大小均一的透明球状,性质稳定;MNEVs均匀分散在水凝胶微球之中,可在两周的时间内完成缓释。细胞吞噬实验显示水凝胶微球释放的MNEVs可成功被大鼠神经干细胞以及RAW264.7单核巨噬细胞吞噬。MNEVs@GM在体外展现出了对于神经再生的积极作用。CCK-8实验证明其释放的MNEVs可有效促进神经干细胞的增殖;GFAP、MAP2及TUJ1免疫荧光染色证明MNEVs可抑制神经干细胞向星形胶质细胞分化,而促进神经干细胞向神经元分化,且效果较未经褪黑素预处理的NEVs更佳;qRT-PCR实验验证了免疫荧光染色的结论同;GAP43免疫荧光染色则说明MNEVs@GM可促进轴突生长。CD206与iNOS免疫荧光染色以及流式细胞术共同说明MNEVs@GM能够促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,而NEVs@GM则未表现出这项作用。qRT-PCR实验证明MNEVs@GM可下调验证相关基因如iNOS,IL-1β,IL-6与TNF-α等,且抗炎效果较负载未经褪黑素预处理外泌体的NEVs@GM更佳。另外,动物实验当中,经原为注射后,MNEVs@GM在脊髓损伤小鼠体内实现了 MNEVs的缓释,在损伤部位富集约4周时间。经MNEVs@GM治疗的脊髓损伤小鼠,BMS及LSS评分显著提高,神经电生理检测也证明其运动功能得到明显改善。在对脊髓损伤小鼠的脊髓组织进行组织学分析之后,我们发现MNEVs@GM可抑制损伤区域的巨噬细胞浸润,同时促进局部M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,而负载未经褪黑素预处理外泌体的NEVs@GM则不具备这种功能。组织切片NF-200及MBP免疫荧光染色则证明MNEVs@GM可帮助损伤区域神经纤维及髓鞘再生。另外,经MNEVs@GM治疗后,小鼠主要器官未产生病变,肝肾功能也无异常,证明其具有良好的生物安全性。研究结论:褪黑素预处理促进了大鼠神经干细胞的增殖与外泌体分泌,且提高了 NEVs促神经再生的能力,并赋予其抗炎特性。我们成功制备了 MNEVs@GM水凝胶微球递送系统,为脊髓损伤的治疗提供了新的方法。MNEVs@GM在体外展现出了调控炎症以及促神经干细胞分化的作用,在动物体内实现了损伤区域生物活性MNEVs的缓释,抑制了损伤区域的炎症反应,促进了神经组织再生,有效治疗了小鼠脊髓损伤。