背景:很多骨科疾病都会导致骨缺损,例如开放性骨折引起的骨块丢失、骨肿瘤瘤段切除术后、骨髓炎病灶清除术后等。骨缺损治疗周期长,医疗花费高,患者心理负担大,历来是骨科医师治疗的难点。如何促进骨缺损的修复已成为近年来的热点话题。而骨缺损之所以修复效果差,主要原因在于骨缺损处血供的缺失,因此骨缺损的修复重在血供的恢复。而大量文献表明,M2型巨噬细胞可以促进局部血管化的形成,为骨缺损部位的修复提供必要支持,但如何精确且有效的促进M2型巨噬细胞的极化成为了研究的关键所在。大量文献表明,充足的血供是骨缺损修复的前提。局部血供的恢复可以为骨细胞带来增殖与IDN-6556纯度分化所需要的营养物质及能量,也可以产生多种细胞因子介导骨细胞的成熟,而代谢废物也会随着循环的建立被带走。为了促进骨缺损部位的局部血管化,骨科医师们作了大量的研究。M2型巨噬细胞,具有良好的促进局部血管化的功能,为骨缺损修复的调节提供了理想的条件。我们知道,巨噬细胞可以分化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞,M1型巨噬细胞主要通过分泌促炎症因子和趋化因子,起提呈抗原的作用,并参与到免疫应答、免疫监视的功能中来。而M2型巨噬细胞抗原提呈能力较弱,但可以下调免疫反应,起到促进血管生成的作用。如何促进巨噬细胞更多的分化为M2型巨噬细胞,将Japanese medaka成为解决骨缺损部位局部血管化问题的关键。随着近年来研究的深入,学者们发现MSCs作为干细胞的一种,在其分泌的细胞外泌体中,含有丰富的miRNA-146,可以促进M2型巨噬细胞极化。但如何促进MSCs分泌更多的外泌体呢?尽管学界对外泌体的研究由来已久,但如何精确的调控MSCs外泌体的分泌仍较少报道。通过对MSCs的研究发现,外泌体的前体为细胞内的多囊小泡,随着多囊小泡的逐渐成熟,其将会面临两种结局。一是被细胞内的溶酶体分解,二是通过跨膜运输转运出细胞。因此,我们得到启发,可以从减少细胞内溶酶体对多囊小泡的分解入手,调节MSCs的外泌体分泌。FPRs是一种分布于MSCs上的受体。有三种亚型,分别是FPR1,FPR2和FPR3。其中FPR2通路被激活后,将会通过加强细胞通信以及调节特定蛋白的表达等方面来促进MSCs分泌外泌体。根据我们团队之前的研究成果得出,WKYMVm(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2)肽,是一种根据不同序列而被专门设计的多肽,具有激活MSCs上FPR2通路的作用。鉴于WKYMVm肽具有制作方便,生物相容性好,价格便宜,生物功能效率高等优势,是细胞通路激活剂的一个理想选择。结合之前相关学者的研究,我们提出假说,当FPR2通路被WKYMVm肽激活后,会引起mBMSCs内的一种炎症相关类泛素化蛋白ISG15的表达下降,导致溶酶体的活性受到抑制,细胞内多囊小泡被溶酶体的分解减少,更多的多囊小泡以外泌体的形式分泌出来。在本研究中我们证明了这一假说。该效应可以被FPR2通路的抑制剂WRWWWW(WRW4,H-Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-OH)肽阻断。除此之外,我们进一步提出假说,当FPR2通路被WKYMVm肽激活后,将使得细胞内转录促进因子TFEB表达降低。文献显示,TFEB为激活溶酶体活性的重要因子,而溶酶体活性增加势必导致细胞内多囊小泡被分解增加及外泌体释放减少。这一假说也在本研究中得到了证实。该效应也可以被FPR2通路的抑制剂WRW4肽阻断。在我们更进一步的研究中,我们证实了mBMSCs中的ISG15和TFEB的表达降低将会引起溶酶体活性的下降,不出意外的是,这种FPR2通路激活后引起的溶酶体活性下降的效应同样也可以被WRW4肽这BMS-907351体外种FPR2通路的抑制剂阻断。之前有研究证明,MSCs分泌的外泌体能够促进M2型巨噬细胞极化,因此我们预测,通过WKYMVm肽激活FPR2通路可以促进mBMSCs分泌外泌体并进一步促进M2型巨噬细胞极化。这也在本研究中得到了证实。该效应可以被FPR2通路的抑制剂WRW4肽阻断。M2型巨噬细胞的极化将带来局部血管化作用的加强,为骨缺损的修复提供必要条件及更有利的微环境。本研究首先进行了mBMSCs的培养,并将WKYMVm肽作为FPR2通路的激动剂加入到mBMSCs当中去。然后通过检测ISG15的表达,TFEB的表达以及溶酶体活性等方法并与未加入WKYMVm肽的对照组比较来验证FPR2通路激活后mBMSCs内发生的一系列反应。也对将WKYMVm肽和WRW4肽加入进去后发生的反应进行测量。第二步,我们通过测定mBMSCs分泌的外泌体的含量并与未加入WKYMVm肽的对照组比较来证实外泌体分泌增加。该效应可以被FPR2通路的抑制剂WRW4肽阻断。第三步,我们将RAW 264.7细胞加入到WKYMVm肽条件培养基中,通过测定M2型巨噬细胞的极化数量并与未加入WKYMVm肽的培养基组以及WKYMVm肽联合WRW4肽条件培养基组进行比较,明确了mBMSCs分泌的外泌体具有促进M2型巨噬细胞极化的作用。该效应也可以被FPR2通路的抑制剂WRW4肽阻断。最后,我们通过对mBMSCs分泌的外泌体中含有的miRNA进行测序,发现同相关文献的研究结果一致,即miRNA-146的表达量最高。然后我们将RAW 264.7细胞加入到WKYMVm肽条件培养基中和含有miRNA-146抑制剂的WKYMVm肽条件培养基中,通过测定M2型巨噬细胞在上述两个组中的极化数量,证实了是mBMSCs分泌的外泌体中的miRNA-146起到了促进M2型巨噬细胞极化的作用。与体外实验的结果相一致的是,我们通过建立小鼠股骨骨缺损的模型,使用WKYMVm肽通过激活mBMSCs上的FPR2通路,来促进外泌体的分泌增加,最终导致的M2型巨噬细胞极化增多的效应可以使得小鼠股骨骨缺损部位的局部血管化增加以及促进进一步的骨缺损部位的修复。通过对上述几个方面的机制探讨,本研究找到了一种促进局部血管化的新方法,为骨缺损修复的进一步研究提供了新的思路和方向。主要研究内容及方法:1.体外培养、孵化mBMSCs及RAW 264.7细胞。然后使用CCK-8试剂盒来检测WKYMVm肽对mBMSCs是否有细胞毒性作用。最后根据本研究的需要制备WKYMVm肽条件培养基和WKYMVm肽联合WRW4肽条件培养基。2.通过Western Blotting和qRT-PCR来检测mBMSCs内ISG15和TFEB的表达,探讨了WKYMVm肽激活FPR2通路后,是否会引起细胞内ISG15和TFEB表达下降。然后通过溶酶体活性检测试剂盒来测定mBMSCs内溶酶体的活性,继续探讨WKYMVm肽激活FPR2通路后,是否引起细胞内溶酶体活性的下降。3.通过外泌体提取试剂盒提取mBMSCs分泌的外泌体,使用电镜和纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)对提取的外泌体进行鉴定。然后使用Westren Blotting测定mBMSCs分泌的外泌体的含量,探讨了WKYMVm肽激活FPR2通路后,是否将会引起mBMSCs分泌外泌体增加。4.通过免疫荧光法和Western Blotting测定RAW 264.7细胞加入到WKYMVm肽条件培养基中后M2型巨噬细胞的极化数量。探讨了mBMSCs分泌的外泌体是否具有促进M2型巨噬细胞极化的作用。接下来还需对mBMSCs分泌的外泌体中的miRNA进行测序,以期找出表达量最高的miRNA。最后通过转染的方式将miRNA-146的抑制剂加入到WKYMVm肽条件培养基中,然后使用Western Blotting测定了将RAW 264.7细胞加入到WKYMVm肽条件培养基中和含有miRNA-146抑制剂的WKYMVm肽条件培养基中后的M2型巨噬细胞的极化数量。探讨了是否是mBMSCs分泌的外泌体中含有的miRNA-146具有促进M2型巨噬细胞极化的作用。5.通过建立小鼠的股骨骨缺损模型,运用免疫组化和免疫荧光的方式,探讨了WKYMVm肽通过激活mBMSCs上的FPR2通路后促进外泌体分泌是否能在体内实验中促进骨缺损部位的局部血管化。同样,在小鼠的股骨骨缺损模型建立后,运用显微CT的方式,探讨了WKYMVm肽通过激活mBMSCs上的FPR2通路后促进外泌体分泌是否能在体内实验中促进骨缺损部位的修复。结果:1.成功培养、孵化、扩增mBMSCs及RAW 264.7细胞。通过CCK-8试剂盒检测后证实了当WKYMVm肽的浓度位于1μmol/L时,对mBMSCs无细胞毒性作用。并成功制备了后续实验需要的WKYMVm肽条件培养基和WKYMVm肽联合WRW4肽条件培养基。2.通过Western Blotting和qRT-PCR来检测WKYMVm肽组中mBMSCs内ISG15和TFEB的表达并与未加入WKYMVm肽的对照组以及WKYMVm肽联合WRW4肽组进行比较,证实了WKYMVm肽激活FPR2通路后确有降低细胞内ISG15和TFEB表达的作用。同时通过溶酶体活性检测试剂盒来测定WKYMVm肽组中mBMSCs内溶酶体的活性并与未加入WKYMVm肽的对照组以及WKYMVm肽联合WRW4肽组进行比较,证实了WKYMVm肽激活FPR2通路后确有降低细胞内溶酶体活性的作用。3.通过外泌体提取试剂盒成功提取了mBMSCs分泌的外泌体,并使用电镜和纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)的方式成功鉴定了提取的外泌体的形态,粒径分布和浓度情况。然后使用Westren Blotting测定了WKYMVm肽组中mBMSCs分泌的外泌体的量并与未加入WKYMVm肽的对照组以及WKYMVm肽联合WRW4肽组进行比较,证实了WKYMVm肽激活FPR2通路后,可以增加mBMSCs外泌体分泌的量。4.通过免疫荧光法和Western Blotting测定了RAW 264.7细胞加入到WKYMVm肽条件培养基中后M2型巨噬细胞的极化数量并与未加入WKYMVm肽的培养基组以及WKYMVm肽联合WRW4肽条件培养基组进行比较。证实了mBMSCs分泌的外泌体确有促进M2型巨噬细胞极化的作用。同时对mBMSCs分泌的外泌体中含有的miRNA的测序结果也提示miRNA-146的表达量最高。最后通过转染的方式将miRNA-146的抑制剂加入到WKYMVm肽条件培养基中,然后通过Western Blotting测定了将RAW 264.7细胞加入到WKYMVm肽条件培养基中后M2型巨噬细胞的极化数量并与含有miRNA-146抑制剂的WKYMVm肽条件培养基组进行比较。证实了是mBMSCs分泌的外泌体中的miRNA-146起到了促进M2型巨噬细胞极化的作用。5.通过建立小鼠的股骨骨缺损模型,运用免疫组化和免疫荧光的方式,证实了WKYMVm肽通过激活mBMSCs上的FPR2通路后促进外泌体分泌能够在体内实验中促进骨缺损部位的局部血管化。同样,在小鼠的股骨骨缺损模型建立后,运用显微CT的方式,证实了WKYMVm肽通过激活mBMSCs上的FPR2通路后促进外泌体分泌能够在体内实验中促进骨缺损部位的修复。结论:1.WKYMVm肽激活FPR2通路后能够通过调节mBMSCs内溶酶体的活性来促进外泌体的分泌。2.mBMSCs分泌的外泌体能够促进M2型巨噬细胞的极化。3.WKYMVm肽能够通过激活mBMSCs上的FPR2通路以促进外泌体分泌并在体内实验中起到促进骨缺损部位的局部血管化以及修复骨缺损部位的作用。