目的:本研究拟在DLBCL的组织、外周血及细胞水平观察LAG-3、PD-1的表达情况,联合使用LAG-3、PD-1抑制剂是否可提高单药治疗的有效率具有重要临床意义,也为个体化治疗提供新思路。方法:第一部分:1)选择石蜡包埋组织病理结果诊断为DLBCL的患者146例为实验组,反应性增生淋巴结30例为对照组。2)回顾性分析DLBCL的流行病学特点、临床病理特征及形态学基本特征,结合免疫组织化学结果分析DLBCL中GCB和non-GCB的临床病理特征关系。3)使用免疫组织化学方法检测DLBCL实验组和反应性增生淋巴结对照组LAG-3、PD-1的表达情况,分析两者表达与临床病理特征的相关性。4)绘制Kaplan-Meier曲线估计总体生存预后分布,采用Cox回归模型进行多因素生存分析。第二部分:1)收集DLBCL患者外周血样本92例及健康对照组外周血样本30例,流式细胞检测T淋巴细胞亚群的比例及T淋巴细胞上LAG-3、PD-1在实验组和健康对照组之间的差异表达与临床病理特征的相关性。2)收集上述部分DLBCL患者外周血血清样本70例及健康对照组外周血血清样本30例,利用CBA检测上述外周血血清样本细胞因子水平差异与T淋巴细胞上LAG-3、PD-1表达及临床病理特征的相关性。第三部分:通过磁珠分选DLBCL患者外周血CD8~+T细胞与肿瘤细胞(SU-DHL6、OCI-LY3)分别进行共培养,分别加入LAG-3与PD-1阻断剂,培养后再次利用磁珠分选出CD8~+T细胞,流式检测CD8~+T细胞表面LAG-3与PD-1表达情况,流式细胞内染色检测CD8~+T细胞穿孔素、颗粒酶B表达情况,Annexin V/7-AAD流式细胞检测肿瘤凋亡,细胞上清应用CBA检测IFN-γ的表达情况。结果:第一部分:DLBCL患者146例,患者多见于中年男性,平均年龄为57岁,首发临床症状以颈部淋巴结肿大较为常见,伴有发热。病变多位于脑部、胃肠,少数累及口腔、脊柱、乳腺、肾脏、睾丸,外周血检查常合并淋巴细胞计数减少、LDH增高。根据Hans分型selleck HPLC对DLBCL进行免疫分型:GCB亚型51例(34.9%),non-GErastin IC50CB亚型95例(65.1%)。CD10表达率为24%,BCL-6表达率为80.8%,MUM-1表达率为82.2%,BCL-2表达率为37%,C-MYC表达率为28.8%,Ki-67表达率为82.2%,DLBCL中的non-GCB亚型与患者IPI>3分评分相关。在组织水平证实LAG-3、PD-1在DLBCL TILs广泛表达,LAG-3阳性表达率(n=71/144,49.3%),PD-1阳性表达率(n=75/142,52.8%)。LAGIntrapartum antibiotic prophylaxis-3和PD-1阳性共表达率占32.1%(n=45/141),单独表达LAG-3阳性或者PD-1阳性表达率占34.3%(n=48/141)。与临床病理特征分析发现LAG-3阳性表达与肿瘤侵犯结内相关,PD-1阳性表达在年龄>60岁、BCL-2阳性表达均具有相关性,LAG-3和PD-1阳性共表达与年龄>60岁具有相关性。结合临床病理特征及LAG-3、PD-1表达情况进行单因素分析,将有统计学意义的单因素纳入多因素生存分析,年龄大于60岁、淋巴细胞计数降低、LAG-3阳性表达是DLBCL患者OS的独立预后危险因素。第二部分:本研究外周血样本证实DLBCL患者CD4~+T细胞比例降低,CD8~+T细胞比例增高,T细胞亚群向CD8~+T细胞亚群偏移,CD4~+/CD8~+T细胞比值进一步降低。PD-1高表达在CD8~+T细胞,LAG-3在CD4~+T、CD8~+T细胞上均高表达,CD8~+T细胞上LAG-3和PD-1均高表达。进一步分析LAG-3~+CD4~+T、PD-1~+CD8~+T、LAG-3~+CD8~+T、LAG-3~+PD-1~+CD8~+T细胞与临床病理特征相关性发现LAG-3~+CD8~+T细胞与IPI>3分、LDH≥250(U/L)有关。选择上述部分DLBCL患者外周血检测细胞因子发现IL-6、IL-10、IL-2、IL-4水平升高,TNF-α、IFN-γ水平降低,且IFN-γ表达水平降低与年龄>60岁、III、IV临床分期、结外侵犯个数≥2、LDH≥250(U/L)、IPI>3分具有相关性。进一步将IL-6、IL-10、IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ与LAG-3~+CD4~+T、PD-1~+CD8~+T、LAG-3~+PD-1~+CD8~+T细胞与细胞因子水平统计相关性分析后发现IFN-γ水平与LAG-3~+CD8~+T细胞比例呈负相关。第三部分:本研究继续在细胞水平证实,DLBCL患者CD8~+T细胞和SU-DHL6/OCI-LY3体外共培养后,单独加入LAG-3或PD-1抑制剂后CD8~+T细胞穿孔素、颗粒酶B表达比例增加和IFN-γ分泌水平增高,肿瘤细胞总凋亡比例增加。联合使用LAG-3和PD-1抑制剂,穿孔素、颗粒酶B表达比例和IFN-γ分泌水平效果优于单独使用LAG-3或PD-1抑制剂,肿瘤细胞总凋亡显著增加。结论:LAG-3、PD-1在DLBCL组织TILs、外周血中广泛高表达,且与预后、分期等具有相关性,T淋巴细胞表面免疫抑制性受体异常表达,可能导致T细胞增殖和分化受阻,亚群比例失衡,细胞功能异常,CD8~+T可能是受到免疫抑制的重要细胞亚群之一,联合LAG-3和PD-1抑制剂恢复CD8~+T分泌细胞因子功能优于单独使用抑制剂。LAG-3、PD-1高表达对CD8~+T细胞功能都有较强的抑制作用,从而导致杀伤肿瘤细胞功能减弱,联合阻断LAG-3和PD-1将有助于免疫细胞功能的恢复,为DLBCL个体化细胞免疫治疗提供新的指导方向。