研究背景卵巢癌是发病率较高的妇科恶性肿瘤之一。由于卵巢癌发病位置隐匿,早期诊断困难,半数以上患者在确诊时已发生远处转移。因此化疗是临床治疗卵巢癌的常用手段。大部分的化疗药物是通过引起细胞凋亡来清除肿瘤细胞。残余癌细胞是肿瘤复发转移的根源。出现残余癌细胞的一个原因是一部分细胞无法启动凋亡,导致化疗抵抗。近年来新发现的细胞重生(anastasis)是导致化疗后复发转移的另一种可能。细胞重生是细胞在凋亡压力下激活了效应Caspase分子后存活的现象。有研究发现,宫颈癌细胞、乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞在化疗药物处理后均有不同比例的细胞重生发生,而且重生的肿瘤细胞的恶性行为发生改变,如具有更强的耐药性和迁移能力,提示肿瘤细胞可能会通过细胞重生来避免化疗引起的细胞死亡,进而导致癌症复发和转移。目前对于细胞重生在卵巢癌发生发展中的作用尚无研究。解析细胞重生对卵巢癌细胞恶性行为的影响及其作用机制可以拓宽我们对卵巢癌复发转移机制的认识,并为预防肿瘤复发转移提供新的药物靶点。研究目的研究卵巢癌细胞在凋亡压力下是否会发生细胞重生、细胞重生对卵巢癌细胞恶性行为的影响及其作用机制。方法与结果1.卵巢癌细胞在凋亡诱导药物处理后可以发生细胞重生为了研究卵巢癌细胞能否发生细胞重生,本课题选择了 HEY和A2780两种卵巢癌细胞系做为研究模型。首先利用慢病毒构建了稳定表达效应Caspase活性报告子GC3AI的HEY-GC3AI和A2780-GC3AI细胞系。然后选取两种通过不同途径诱导凋亡的药物TRAIL和紫杉醇分别处理携带GC3AI的卵巢癌细胞24h后移除药物。流式细胞术检测发现TRAIL和紫杉醇处理细胞24 h可以引起部分细胞发生效应Caspase的激活。实时成像结果显示移除药物后,一些激活了效应Caspase的细胞可以逐渐恢复正常的细胞形态,存活下来,即发生了细胞重生。2.细胞重生导致促血管生成和细胞迁移相关基因表达上调1)构建mCasExpress示踪系统:为了能够标记和长期追踪重生后的细胞,本课题构建了可以在哺乳动物细胞表达、并能标记经历过效应Caspase激活的细胞及其子细胞的示踪系统mCasExpress。稳定表达该示踪系统的细胞经过凋亡诱导药物处理后,发生细胞重生的细胞会表达荧光蛋白ZsGreen。利用慢病毒向HEY和A2780细胞中转入mCasExpress,建成稳定携带mCasExpress的细胞系,并用TRAIL和紫杉醇(PTX)处理,证实mCasExpresEmricasan价格s可以标记重生细胞。2)重生细胞内促血管生成和迁移相关基因上调:为了分析细胞重生对卵巢癌细胞基因表达谱的影响,本研究首先利用流式分选术从药物处理后恢复的卵巢癌细胞中分选获得重生细胞(ZsGreen+细胞)、凋亡抵抗细胞(未激活效应Caspase的细胞)。同时将溶剂处理的细胞通过流式分选收集作为对照细胞。在对三组细胞进行长期培养后进行RNA测序分析。结果显示,差异表达基因富集在细胞迁移和血管生成相关通路。RT-qPCR验证结果显示MMP1、MMP9、TNFA、VEGFA、VEGFC、PTGS2、NEDD9、CXCL10 和GREM19个基因在TRAIL和紫杉醇处理后的重生细胞(HEY-ZsGreen+和A2780-ZsGreen+细胞)中均表达上调。这些结果提示细胞重生可能影响卵巢癌细胞促血管生成能力和迁移能力。3.细胞重生对卵巢癌细胞恶性行为的影响1)细胞重生促进血管生成和移植瘤生长:测序结果提示细胞重生上调促血管生成基因表达。为此,本课题通过收集对照、ZsGreen-和ZsGreen+三组细胞的条件培养基进行ELISA检测,结果证实ZsGreen+的重生细胞分泌更多的VEGFA、VEGFC、TNFα和PGE2等促血管生成因子。用条件培养基诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移和成管实验显示,来自ZsGreen+细胞的条件培养基具有更强的促进HUVEC细胞迁移和成管能力。基质胶栓实验分析显示,来自ZsGreen+细胞的条件培养基具有更强的促进体内血管生成能力。移植瘤实验结果显示,ZsGreen+细胞形成的移植瘤生长更快,肿瘤中Ki67+细胞更多、血管内皮细胞标志物CD31+染色也更多。但三组细胞在体外的增殖能力没有显著差异,提示体内移植瘤生长加快是由于肿瘤血管生成增加所致。2)细胞重生促进卵巢癌细胞迁移和体内转移:利用transwell实验对比分析了三组细胞的迁移能力,结果显示,ZsGreen+细胞比ZsGreen-和对照细胞具有更强的迁移能力。将荧光素酶标记的三组细胞分别注射到NCG小鼠腹腔内,活体荧光成像和解剖及组织学分析显示ZsGreen+细胞在腹腔内的扩散范围远大于其他两组,且发生更多的内脏器官转移。以上结果说明重生的卵巢癌细胞通过促进血管生成和细胞迁移能力而加重其恶性行为。4.细胞重生改变卵巢癌细胞恶性行为的机制1)细胞重生促进血管生成的机制:RNA测序结果分析显示差异表达基因富集于TNFR信号通路,该通路下游的多个蛋白激酶具有促进血管生成作用。为此,本研究首先通过Western Blots检测了 JNK、ERK、p38、Akt和NFκB的活性。结果发现只有p38在所有ZsGreen+细胞中显著激活,利用p38抑制剂和siRNA干扰p38活性或表达,能抑制促血管生成基因的表达上调。进一步分析发现,抑制对照、ZsGreen-和ZsGreen+细胞内p38表达或活性,可以减少三类细胞条件培养基所诱导的HUVEC细胞迁移和体外成管的差异;体内基质胶栓实验也证实p38抑制剂能抑制ZsGreen+细胞的条件培养基促进体内血管生成的作用。2)细胞重生促进卵巢癌细胞迁移的机制:Transwell实验结果显示,siRNA干扰p38表达和抑制剂抑制p38活性均能抑制重生引起的卵巢癌细胞迁移能力增强;我们也评估了 TNFR信号通路中的其他关键激酶对重生细胞迁移能力的影响。结果显示,抑制JNK、NFκB或ERK的活性,也可降低ZsGreen+细胞的迁移,提示重生细胞迁移的增强需要多种激酶的参与。3)p38在细胞凋亡诱导和早期恢复过程中被Caspase激活:为了分析重生细胞内p38活性上调的机制,我们对药物处理期间及恢复早期细胞的p38活性进行了检测。Western Blots分析结果显示,p38在凋亡阶段被激活,并在早期恢复过程中进一步升高,在凋亡诱导和恢复早期使用qVD抑制Caspase的活性,可以抑制p38的磷酸化水平,说明p38的激活依赖于Caspase活性。而且促血管生成基因的表达上调也发生在重生早期,并依赖于Caspase激活。4)p38激活可以促进重生:为了分析p38激活对细胞重生的影响,本研究联合运用检测效应Caspase激活的GC3AI体系和检测细胞Medical Abortion重生的mCasExpress体系,检测p38抑制剂SB203580处理对细胞重生的影响,发现抑制p38活性显著降低TRAIL或紫杉醇处理的卵巢癌细胞的重生比例。说明p38的激活是卵巢癌细胞在凋亡压力下重生所需要的。结论1)卵巢癌细胞在凋亡压力下可以重生;2)重生的卵Docetaxel molecular weight巢癌细胞促血管生成和迁移能力增强;3)重生细胞促血管生成和迁移能力的增强依赖于p38的激活;4)在凋亡诱导和早期恢复阶段,活化的caspase激活p38,促进细胞重生。