环状RNA hsa＿circ＿0008833编码小肽促进支气管上皮细胞16HBE焦亡的研究

目的:验证hsa＿circ＿0008833能够编码活性小肽,探究hsa＿circ＿0008833编码小肽在支气管上皮细胞焦亡中的作用机制。方法:1、构建融合3Flag表达的hsa＿circ＿0008833过表达、阴性对照载体(NC)、融合3Flag标签蛋白的编码小肽(ORF-Flag)与编码小肽突变载体(ORF-MUTFlag),分别转染支气管上皮细胞16HBE。2、Westren blot技术检测Flag标签蛋白表达,并与预期的条带大小进行对比。3、采用CCK-8实验、PI染色及流式细胞术metabolomics and bioinformatics检测各组细胞的增殖和死亡。4、采用q PCR技术及Westren blot技术检测细胞焦亡上下游通路相关因子的m RNA及蛋白表达。结果:1、通过Westren blot技术检测转染后各组细胞中Flag标签蛋白表达,在hsa＿circ＿0008833组与ORF-FLAG组中检测到Flag标签蛋白表达,且条带大小为17 k Da,符合预期编码的小肽大小,即57个氨基酸*110dalton=6.27 k Da,加上融合的3FLAG标签11 k Da,共计17.27 k DaBlebbistatin供应商大小。验证了具有正常IRES位点的hsa＿circ＿0008833可以成功编码57个氨基酸的小肽。2、CCK-8实验Baricitinib小鼠结果显示,hsa＿circ＿0008833过表达及ORF过表达能抑制支气管上皮细胞增殖。PI染色及流式细胞结果显示,hsa＿circ＿0008833过表达及ORF序列过表达会促进支气管上皮细胞的死亡。3、q PCR实验结果显示,hsa＿circ＿0008833过表达及ORF序列过表达能促进焦亡通路相关因子caspase1、IL-18、IL-1β、NLRP3、ASC m RNA的表达。Westren blot实验结果显示,hsa＿circ＿0008833过表达及ORF序列过表达促进焦亡通路相关因子caspase1、IL-18、ASC、GSDMD蛋白的表达。结论:1、环状RNAhsa＿circ＿0008833能编码全长57aa的小肽。2、hsa＿circ＿0008833编码小肽能抑制支气管上皮细胞增殖。3、hsa＿circ＿0008833编码小肽可能通过caspase-1经典炎症体途径促进支气管上皮细胞发生焦亡。