【研究背景及目的】多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种由单克隆浆细胞恶性增殖而引起一系列临床症状的疾病。多发性骨髓瘤的发病率约为十万分之四点五至十万分之六,是血液系统第二高发的恶性肿瘤。其好发于颅骨、骨盆等扁骨,常引起骨质Self-powered biosensor破坏、高钙血症、贫血以及肾功能不全等临床症状。近年来随着新型治疗方案的推广、诊疗水平的进步,多发性骨髓瘤患者的预后得到明显改善。然而,目前尚无根治多发性骨髓瘤的方法,患者仍面临着多线治疗后病情进展的困境,最终面临无法医治的局面。因此,深入探究多发性骨髓瘤的发病机制、开发新型预后标志物、鉴定潜在的治疗靶点、改善患者预后是十分必要的。既往研究表明98%的基因组转录产生非编码RNA(Non coding RNA,nc RNA),而nc RNA在多个生理及病理过程中发挥着重要的调节作用。Circ RNA是nc RNA中较为特殊的种类,其5’端和3’端以共价键相连成环,结构上明显区别于m RNA及其他nc RNA。随着测序技术与生物信息学的不断发展,大量肿瘤细胞内特异性表达的circ RNA被发现,其在肿瘤发生发展过程中的作用被揭示,为进一步以circ RNA为诊疗靶点的研究奠定了理论基础。近期研究提示,作为circ RNA内的特殊结构,核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)可招募核糖体至开放阅读框(open reading frame,ORF)翻译多肽或蛋白,调节肿瘤细胞的生物学功能。这极大地拓宽了nc RNA的研究范围,明确这些肽类在肿瘤细胞中的调节功能及分子机制,会对预测肿瘤患者预后、提高抗肿瘤治疗效果、寻找潜在治疗靶点提供全新的方向。本课题拟探寻在多发性骨髓瘤细胞内特异性表达的circ RNA,对其在多发性骨髓瘤细胞中发挥的生物学功能及潜在翻译功能性蛋白机制进行研究,并为明确多发性骨髓瘤发病机制、制定以nc RNA或多肽分子为基础的治疗策略提供新的理论依据。【研究方法】1.利用SBC芯片及GEO数据库数据筛选MM中关键差异表达circ RNA分子并验证差异本研究借助磁珠分选技术分别获取患者肿瘤细胞及正常志愿者浆细胞。通过SBC human ce RNA array V1.0芯片获取circ RNA和m RNA表达数据,筛选出在MM细胞中差异表达的circ RNA。并结合GEO数据库芯片GSE133058数据进一步筛选差异circ RNA。最后,结合SBC芯片中m RNA数据、共同差异表达的circ RNA数据、样本类型及肿瘤亚型数据等进行加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis,WGCNA),获得MM细胞中关键circ RNA–hsa＿circ＿0000175(后续简称circ ELK4)。2.鉴定circ ELK4的环状结构及检测其在MM细胞中功能设计特异性分离及聚合引物进行PCR及sanger测序鉴定circ ELK4的成环结构,辅以q RT-PCR验证表达差异,荧光原位杂交明确细胞定位。通过转染慢病毒构建稳定敲降及过表达circ ELK4的MM细胞系,结合CCK8、Ed U、细胞周期检测、软琼脂糖克隆形成等细胞功能实验,在体外探究circ ELK4对MM细胞生物功能的调控作用。3.Circ ELK4翻译能力的验证及其翻译蛋白的功能分析及调控下游利用Circ DB及Trans Circ数据库查询circ ELK4结构,预测其编码可能。构建过表达ORF融合Flag序列的circ ELK4的细胞系及过表达circ ELK4翻译蛋白序列的细胞系,结合功能学实验、Western blot和IP等实验对circ ELK4的编码能力及其编码产物的生物学功能进行验证。最后,因蛋白序列同宿主基因序列的相似性,推测其调控下游靶点一致性,并采用Western Blot的实验方法进行验证。【研究结果】本研究对MG132分选的5例初诊Ig D型MM患者、5例初诊Ig G型MM患者的肿瘤样本以及3例正确认细节常志愿者浆细胞样本进行了SBC human ce RNA array V1.0芯片检测。通过对其获得数据进行标准化处理、分析筛选出在MM中差异表达的circ RNA共6686个,其中表达上调的circ RNA 3341个,表达下调的circ RNA 3345个。结合GSE133058数据集中MM内差异表达的circ RNA的分析结果,我们筛选出在两个数据集中共同差异表达的circ RNA 28个。利用SBC芯片中m RNA数据及差异表达的circ RNA数据进行WGCNA分析,我们得到共表达基因模块11个。其中circ ELK4所在的基因模块与肿瘤表型及其Ig D亚型表型相关度最高。根据计算模块内基因间的连通性计算,最终锁定了核心靶分子circ ELK4,值得注意的是多个预测结果提示circ ELK4具有潜在的编码功能,这极大地引起了我们的研究兴趣。特异性分离引物PCR、q RT-PCR、sanger测序的实验结果均验证了circ ELK4的成环结构;FISH实验结果提示circ ELK4细胞定位以胞质为主。功能实验结果显示,过表达circ ELK4后MM细胞增殖能力提高,敲降circ ELK4后结果相反。我们通过生物信息学预测发现circ ELK4内具有IRES及翻译439aa的ORF结构,并利用Western blot和IP实验验证了circ ELK4翻译蛋白的能力。功能学实验结果显示circ ELK4翻译的439aa蛋白同circ ELK4一致,均可显著促进肿瘤细胞增殖。机制上,我们发现circ ELK4编码439aa蛋白可能通过提高MM细胞内c-FOS蛋白水平促进肿瘤细胞增殖,进而影响MM的发生发展。【研究结论】MM细胞中特异性高表达circ RNA-circ ELK4,circ ELK4可通过编码439aa蛋白上调细胞内c-FOS蛋白水平,进而促进MM细胞增殖。本项研究结果提示circ ELK4有望成为MM潜在的治疗靶点。