新疆光照充足,昼夜温差大,土壤无污染,是我国优质红枣的主产区。新疆红枣主要产于南疆的喀什、阿克苏、和田、巴州和新疆生产建设兵团的各师团。枣疯病是发生在枣树上的高致死病害,感病枣苗在第2年即表现出典型的丛枝症状,少数在第3年发病。2012年,阿克苏、喀什相继报道有枣疯病的发生,同年关于枣疯病在新疆危害的风险分析结果显示,它在新疆是一种高度危险的林业有害生物,目前,关于新疆地区枣疯病的昆虫传播介体尚未得到试验证实,苗木或接穗带菌是新疆枣疯病传播的主要途径。2021年,在新疆阿拉尔市塔里木大学校园内发现1株枣疯病典型症状的病树,经调查该树树龄为34年,品种为赞皇枣,在此前自栽植后未进行任何嫁接,不存在病接穗传病的可能,另外,通过周年观察该病树上只有截形叶螨(Tetranychus truncatus Ehara)发生,此前,未有阿拉尔枣疯病鉴定的相关报道,因此,该枣疯病病原的分类地位及来源是否和国内外报道的枣疯病一致,该区域是否还存在隐性带病株都需要用试验进一步检测。本研究以国内外现有枣疯植原体的16S r RNA、Sec A、Sec Y序列为对象,初步分析了枣疯植原体近缘株系的地域分布特性,随后用分子生物学方法对塔里木大学发现的枣疯病典型症状的赞皇枣病树进行了鉴定和溯源,并建立了枣疯植原体Real-time LAMP检测方法,主要研究结果如下:(1)本研究对82条枣疯植原体的16S r RNA、15条Sec A、16条Sec Y序列进行序列多态位点分析、系统进化树分析以及同源性分析,结果显示:不同地理来源的82株分离物16S r RNA基因遗传距离很小,可大致将其分为四个类群:I-印度诸菌株、II-山东诸菌株、III-河北诸菌株,IV-陕西与河南诸菌株。其中,印度诸菌株与其它菌株的亲缘关系最远,有明显的地理隔离,而陕西与河南诸菌株及河北诸菌株亲缘关系较近,其次为山东诸菌株,河北诸菌株与山东诸菌株的亲缘关系最近。相对于16S r RNA基因,不同地理来源分离物的Sec A基因与Sec Y基因遗传距离更大,均可明显将其划分为两个类群:I-印度诸菌株、II-山东诸菌株。表明枣疯植原体分离物近缘株系之间呈现一定地域相关性。本研究可为枣疯植原体阿拉尔分离株溯源等相关研究提供参考。(2)对表现出枣疯病典型症状的赞皇枣病树提取植物总DNA,以16S r RNA基因、23S r RNA基因、16-23S r RNA基因、Sec A基因、Imp基因、rp基因以及Sec Y基因的通用或半通用特异性引物进行PCR扩增,将测序得到的基因片段通过Blast比对、同源性比较,构建系统进化树,确定枣疯植原体阿拉尔分离株的分类地位。此外,根据阿拉尔枣疯植原体Sec A基因、Imp基因、rp基因以及Sec Y基因的测序结果,对Sec A蛋白、Imp蛋白、rp S3蛋白、rpl22蛋白、rpl15蛋白以及Sec Y蛋白的理化性质和结构进行了分析和预测。测序结果显示,本研究获得了基因片段长度分别为1334LEE011 bp的16S r RNA基因、2680 bp的23S r RNA基因、380 bp的16-23S r RNA基因、838 bp的Sec A基因、457 bp的Imp基因、1123 bp的rp基因和1341 bp的Sec Y基因,确认感病枣树植株为植原体侵染所致,获得的基因序列与16S r V-B亚组中的枣疯植原体Candidatus Phytoplasma ziziphi(JWB)的相关序列高度同源,命名为枣疯植原体阿拉尔株系(JWB-Alar)。基于上述特定基因核苷酸序列的同源性比对及构建的进化树确定JWB-Alar属于16S r V-B亚组、rp V-C亚组、Sec Y V-C亚组。由于JWB-Alar 16S r RNA基因、16-23S r RNA、Sec Y基因序列与来自河北保定、山东等的枣疯植原体同源性最高,达到100%;JWB-Alar 23S r RNA基因序列与来源于山东的枣疯植原体同源性最高,达到99.92%,JWB-Alar Sec A基因序列与来自山东的枣疯植原体同源性最高,同源性在99.76%以上;JWB-Alar Imp基因、rp基因序列与来自河北保定的枣疯植原体同源性最高,达到100%,而本枣疯病苗木是35年前自河北引进到阿拉尔,溯源JWB-Alar来源于河北省。蛋白分析和预测结果表明,Sec A蛋白、Imp蛋白、rp S3蛋白、rpl22蛋白、rpl15蛋白以及Sec Y蛋白均属于不稳定蛋白,且均被激酶磷酸化,二、三级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主,除Sec A蛋白为亲水酸性蛋白,Sec Y蛋白为疏水碱性蛋白,其余四个蛋白属于亲水碱性蛋白,Imp蛋白和Sec Y蛋白为跨膜蛋白,其它4个蛋白均为非跨膜蛋白,此研究可为筛选哪个蛋白做血清学检测奠定基础。(3)为快速定性定量检测枣疯植原体,在现有LAMP(loop medgenetic immunotherapyiated isothermal amplification,LAMP)检测的基础上,建立Real-time LAMP,对该体系成分和温度进行优化,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性和田间适用性进行了评估。建立的枣疯植原体Real-time LAMP最优反应条件为:ACLR-F3/ACLR-B3(10μmol/L)0.5μL,ACLR-FIP/ACLR-BIP(20μmol/L)1.0μL,Bst II DNA Polymerase 1.5μL,5×LAMP Reaction Mix 5μL,TS LAMP Green(20×)0.45μL,Nuclease-free Water补足至25μL,61℃,60 min。特异扩增JWB(16S r V-B亚组)而不扩增SCWB(16S r XXX组);最低检测限为3.1×10~2copies/μL,是直接PCR的100倍;批内重复性高。此外,对田间有明显症状的1株枣疯病树的枣股、枣吊、枣叶和根(4份)以及周边枣园表型健康的11株相应部位样品(44份)的阳性的检出率分别为75%和4.55%,而直接PCR的阳性检出率分别是50%和0%,建立的Real-tiLapatinibme LAMP可检测到田间隐性带病株,本研究可为阿拉尔枣疯病的前期诊断和防治提供参考。