猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是造成母猪繁殖障碍的重要致病原之一,感染后可造成猪的死木胎综合征(stillbirth,mummification,embryonic death and infertility,SMEDI),即母猪产死胎、木乃伊胎、胚胎发育不良和死亡及母猪不孕等。猪细小病毒4型和6型分别被发现于美国北卡罗来纳州和中国北京,可能为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的潜在致病因子。目前,尚无一种能够同时针对PPV4和PPV6快速、准确、灵敏的检测方法被报道。因此,本研究旨在构建一种快速、准确、敏感的针对PPV4和PPV6的双重荧光定量PCR检测方法,以应用于临床上对PPV4和PPV6的快速检测。此外,由于国内外对于PPV4和PPV6的研究不充分,对其分子遗传特征及感染后的临床相关性仍知之甚少。本研究通过构建的q PCR方法对福建地区规模猪场收集的临床表现为猪呼吸道疾病综合征以及繁殖障碍的样品进行检测,对PPV4和PPV6阳性样品进行全基因组测序,并作系统发育分析。以期了解福建地区PPV4和PPV6的毒株流行情况及其临床相关性,旨在丰富福建地区PPV4和PPV6分子流行病学数据,为PPV4和PPV6的防控提供理论依据。本研究根据PPV4和PPV6全基因组的保守区域基因序列,分别设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的Taqman探针。GW-572016经过条件优化,建立能够同时诊断PPV4和PPV6的双重荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性、稳定性以及与常规PCR方法的符合率进行试验评估。结果显示,该方法能够同时检测鉴别PPV4和PPV6,且特异性良好,与猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及猪细小病毒1型核酸均无交叉反应。本方法灵敏度高,对PPV4和PPV6的最小检出限分别为9.3 copies/μL和7.7copies/μL。组间和组内变异系数均未超过2%,具有良好的重复性。利用所建立的双重荧光定量PCR方法对福建省采集的88份猪血清及组织样本进行检测,PPV4阳性率为12.5%,PPV6阳性率为37.5%,该结果与常规PCR的符合率分别为90.9%和81.8%。利用常规PCR鉴定的阳性样品通过本研究建立的方法复检时均未出现漏检。本研究建立的检测方法对PPV6和PPV4的鉴别诊断、病原监测、流行病学调查等具有重要意义。为调查PPV4、PPV6与PRDC和母猪流产的相关性,从福建省206个规模化猪场采集不同临床症状的猪血清1456份,其中患有PRDC猪血清295份,患有繁殖障碍猪血清209份,患有其他症状猪血清243份,无临床症状猪血清786份。并采集患有PRDC猪肺组织108份,流产胎儿72份。应用本研究构建的PPV4和PPV6双重荧光定量PCR检测方法对上述样品进行检测并对病毒核酸拷贝数定量。结果显示,PPV6在患有PRDC的猪血清和肺组织中有较高阳性率,分别为53.21%和32.41%,在患有繁殖障碍猪血清和流产胎儿组织中阳性率分别为14.39%和22.22%,在患有其他症状和无临床症状猪血清中阳性率分别为26.75%和17.05%。PPV4在不同临床症状猪血清中的阳性率无明显差异,其中在患有PRDC的猪血清和肺组织中阳性率分别为9.63%和8.33%,在患有繁殖障碍猪血清中阳性率为4.55%,在患有其他症状和无临床症状猪血清中阳性率分别为13.58%和5.73%,而在流产胎儿组织中未发现PPV4核酸存在。发病猪血清中,PPV6在猪圆环病毒2型(PCV2)阳性样品中的病毒载量显著高于其在PCV2阴性样品中的病毒载量(p<0.01),PCV2在PPV6阳性样品中的病毒载量显著高于PPV6阴性样品中的病毒载量(p<0.05)。患PRDC猪肺组织中,PPV6和PCV2的病毒载量具有强相关性(R~2=0.4055)。本研究应用PCR技术对PPV4和PPV6全基因组进行扩增克隆测序,以调查福建地区PPV4和PPV6基因组遗传特征。结果显示,成功获得PPV4全基因组序列8条,PPV6全基因组序列29条。8株PPV4全基因组之间同源性为98.9%～100%,与参考毒株之间的同源性为96.0%～99.7%。29株PPV6全基因组之间同源性为96.4%～100%,与参考毒株之间的同源性为96.0%～99.8%。基于PPV4全基因组构建的系统发育树将PPV4分离株与参考株分为两个进化分支,国内参考毒株PPV4-He N16-2015/China/MN326202株与PPV4＿VIRES＿LN01＿C1/China/MK378273株形成一个单独的进化分支,而本研究获得8株毒株与越南参考毒株QT02/Vietnam/MT434668和罗马参考毒株WB-1collective biography95HR/Romania/JQ868714等毒株形成另一个主要的进化分支,表明该分支毒株为福建省主要流行毒株。基于PPV6全基因组构建的系统发育树将PPV6分离株与参考株分为三个进化分支,其中本研究获得的22株毒株与波兰分离株K17-10/Poland/KX384820以及部分国内参考毒株共同形成一个独立的进化分支,表明该分支为福建省主要流行毒株。所获得的1株毒株PPV6-2021NZZFJ066与国内早期分离毒株PPV6-NMG4-1999/China/MN326241株等处于同一进化分支,而其余6株毒株与安徽省分离株AH/China/MK825573以及北京市分离毒株BJ/China/KF999681等共处于同一进化分支。PPV4重组分析显示,所得的8株PPV4均未发现重组信号,而河南分离毒株PPV4-He N16-2015/China/MN326202为推导的重组毒株,主要亲本毒株和次要亲本毒株分别为PPV4＿VIRES＿LN01＿C1/China/MK378273和PPV4-GD23-2017/China/MN326201。PPV6重组分析显示,所得的29株PPV6均未发现重组信号,而河北分离株PPV6＿VIRES＿He B02＿C1/China/MK378369为推导的重组毒株,为河北分离株PPV6＿V购买PR-171IRES＿He B01＿C1/China/MK378368与本研究所获得毒株PPV4-2020Lung FJ074之间重组而来。本研究初步掌握福建省PPV4和PPV6的基因型分布和流行特征,将为PPV4和PPV6的诊断和防控提供一定的理论依据。