环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclomaltodextrin glucanotransferase,CGTase)广泛存在于细菌、真菌、古细菌等各类微生物中,主要生产菌株是各类芽孢杆菌,如环状芽孢杆菌、软化类芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等。CGTase属于α-淀粉酶家族(糖苷水解酶13＿2,GH13＿2),是一种胞外酶,同时也是一种多功能酶,能够以淀粉、麦芽糊精等为底物催化转糖苷反应(歧化、环化和耦合反应)和水解反应。其中,歧化反应是两个不同分子间发生的转糖苷反应,即将直链低聚糖被切断的部分转移到另一受体上。CGTase的应用十分广泛,常见的是利用其环化反应把淀粉转化成环糊精。另外,也常利用CGTase歧化反应生成稳定性提高的糖苷化合物,如将小分子的糖转移到蔗糖或果糖上而生产抗龋齿功能偶合糖;对甜菊苷、鼠李糖、芸香苷、L-抗坏血酸等物质进行糖基化修饰,显著改善其性能。本研究通过合成来源于Bacillus sp.G1的环糊精葡萄糖基转移酶的基因(Bs CGT)来进行歧化特性的改造以及热稳定特性的提高研究,通过定向进化获得了对麦芽糖受体亲和性增强的突变体N33K,可以应用于双酶法合成海藻糖的体系,用以提升海藻糖产率。为适应多酶反应体系条件,又通过半理性改造获得热稳定性提高的突变体N33K/S2PF-02341066配制11G,在最适温度55℃的半衰期提高到94 min。同时,将突变体N33K/S211G在枯草芽孢杆菌进行重组表达,并实现突变体的BIOPEP-UWM database高效制备。主要研究结果如下:(1)合成源自Bacillus sp.G1的CGTase基因并构建p ET28a/cgt载体以大肠杆菌为宿主进行异源分泌表达。通过理性设计,计算可提高麦芽糖特异性结合的氨基酸残基突变,将CGTase进行定点突变改造,构建获得突变体N33K、N33R、Y119R、Y122E、L216Q、H255Y、E258Y、E258Q、P394R、P394Q、E566H,并进行叠加组合突变获得突变体N33K/E258Q、N33K/P394R、E258Q/P394R和N33K/E258Q/P39更多4R,通过酶反应动力学研究发现突变体N33K的k_(cat)相比野生型提高58.6%,突变体N33K相较野生型歧化酶活性提高2.10倍,最适温度55℃,最适pH6.0。(2)研究发现突变体N33K热稳定性尚不能满足工业要求,通过进行钙离子结合位点附近氨基酸定向突变,获得突变体N33K/H255W、N33K/H255F、N33K/H255Y、N33K/I212R、N33K/S211G、N33K/S211E,实验发现突变体N33K/S211G最适温度提高到60℃,在50℃、55℃、60℃、65℃条件下的半衰期分别为2.4 h、2.0 h、55.4 min、38.4 min,N33K/S211G在60℃时的半衰期为突变体N33K的2.27倍,歧化酶活性相较于突变体N33K并没有明显变化。(3)对突变重组菌E.coli BL21/p ET28a-CGTase-N33K/S211G进行摇瓶水平的发酵优化,分别在诱导发酵时间、诱导温度、诱导剂添加量等方面进行了优化,得到了最佳培养条件:最佳生长温度为37℃、最佳诱导温度为25℃、诱导剂最佳添加量为终浓度0.2 m M、最佳诱导发酵时间为8 h。在最优条件下进行摇瓶水平发酵,重组菌所产重组酶歧化酶活性提高28%,歧化酶活达到25.33 U/m L。(4)以麦芽糊精为底物多酶体系复配生成海藻糖的研究中,添加CGTase可将海藻糖转化率提高20%以上,并构建突变体N33K/S211G基因的重组菌B.subtilis WB800N,以TB培养基发酵,发酵温度为37℃,发酵时间为48h,最高歧化酶活可达到21.0 U/mL。