乌鳢水泡病毒(Snakehead vesiculovirus,SHVV)是一种鱼类弹状病毒,其感染乌鳢导致肝脏肿大、脾脏发黑等症状,造成较高的死亡率,目前针对该病毒病还没有有效的防治措施。随着绿色健康养殖理念的推行,接种疫苗成为防治病毒性疾病的有效selleck NMR途径。减毒活疫苗因免疫周期长且能在体内增殖,成为渔用疫苗制备的重要研究方向,而通过细胞传代致弱的途径获得弱毒株是制备减毒活疫苗最经典的方法。本实验室前期将SHVV在斑点叉尾鮰卵巢细胞(Channel catfish ovary cell,CCO)上传代100代,发现与SHVV相比,SHVV-P100对乌鳢的毒力减弱程度较小,本研究在此基础上继续在CCO细胞上传代至P160代,并在传代过程中添加诱导剂5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)诱导病毒突变。取得的主要结果如下:1.SHVV在CCO细胞上的传代我们将SHVV-P100在CCO细胞上连续传至P160代,并在传代过程中添加5-FU或不添加5-FU。将P1、P100、P130、P130-5FU、P160、P160-5FU株以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.01的剂量接种CCO细胞,分别于24 h以及48 h收集上清测定病毒滴度,结果表明:随着传代次数的增加,病毒滴度逐渐升高,这说明传代毒株在CCO细胞上的增殖能力逐渐增强。2.SHVV传代毒株的全基因组测序及突变位点分析对P130、P130-5FU、P160和P160-5FU株进行全基因组测序并与P100株的全基因组序列进行比较,结果表明:与P100株相比,P130株出现了1个核苷酸突变,P160株出现了4个核苷酸突变,但这两者均没有氨基酸突变位点,而P130-5FU株出现了27个核苷酸突变及1个核苷酸的缺失,其中导致了11个氨基酸突变,P160-5FU株出现了71个核苷酸突变,其中导致了20个氨基酸突变。这表明经5-FU诱导突变后提高了传代毒株核苷酸和氨基酸的突变率,加速了毒株的突变。3.SHVV传代毒株对乌鳢的致病性分析将SHVV传代毒株P1、P160、P160-5FU株均以2种剂量(10~5TCID_(50)、10~3TCID_(50))腹腔注射乌鳢,连续观察28 d,结果表明:P1株在以2种剂量注射乌鳢后存活率分别为26.7%、66.7%,P160株2种剂量注射乌鳢后的存活率为66.7%、96.7%,而P160-5FU株2种剂量注射乌鳢后的存活率为83.3%、93.3%。表明P160、P160-5FU株毒力均减弱,其中P160-5FU株毒力最弱。4.P160-5FU株对乌鳢的免疫保护实验为检测P160-5FU株对乌鳢能否起到免疫保护效果,我们以10~5TCID_(50)(10~5TCID_(50)免疫组)、10~3TCID_(50)(10~3TCID_(50)免疫组)2种剂量腹腔注射免疫乌鳢,28 d时采血检测其血清中的抗体滴度。结果表明:10~5TCID_(50)免疫组的抗体滴度达到了1:112,10~3TCID_(50)免疫组的血清中均没有检测到抗体。进一步,我们在免疫28 d后以10~5TCID_(50)剂量的SHVV感染乌鳢,并设立对照组(不免疫仅攻毒SHVV)。在攻毒第4 d时检测乌鳢肝脏、脾脏组织的病毒载量,结果表明:10~5TCID_(50)免疫组乌鳢的肝脏和脾脏的病毒载antibiotic-induced seizures量显著低于10~3TCID_(50)免疫组和对照组(p<0.01)。攻毒后连续观察28 d后发现对照组乌鳢的存活率为27.3%,10~5TCID_(50)免疫组的存活率为63.6%,免疫相对保护率为50%,10~3TCID_(50)免疫组的存活率为31.8%,其免疫相对保护率为6.25%。综上所述,P160-selleck HPLC5FU株可作为制备SHVV的减毒活疫苗的候选毒株。