目的:PD-1/CTLA4双特异性抗体作为最早开发的PD-1双特异性抗体靶点组合,已有多款药物进入临床阶段,但目前鲜有临床前的头对头比较,对其作用机制的研究较少。本文构建并表达纯化三个结构不同的PD-1/CTLA4双特异性抗体Bs Ab1、Bs Ab2、Bs Ab3及其不同亚型对照,通过体外及体内实验鉴定其功能活性,并通过肿瘤浸润淋巴细胞分析(tumor infiltrating lymphocyte,TILs)探讨其潜在的作用机制,研究结果可为双特异性抗体的研发与临床应用提供参考依据。方法:(1)通过基因重组技术构建Bs Ab1、Bs Ab2、Bs Ab3、Bs Ab1-Ig G1、Bs Ab2-Ig G1、Bs Ab2-SI(ADCC增强亚型);(2)经CHO-S细胞转染后,通过Protein A亲和层析纯化抗体,并用SDS-PAGE鉴定抗体分子量;(3)利用SPR检测抗体与PD-1、CTLA4靶点的亲和力;(4)运用荧光素酶报告基因实验及流式细胞术检测抗体的体外阻断活性;(5)运用流式细胞术检测抗体对细胞系的结合活性;(6)基于B-h CTLA4-h PD-1-h PD-L1三靶点人源化小鼠的MC38-h PD-L1结肠癌肿瘤模型建立及药物药效试验;(7)通过肿瘤浸润淋巴细胞分析探讨PD-1/CTLA4双特异性抗体的作用机制。结果:(1)成功构建及表达出Bs Ab1、Bs Ab2、Bs Ab3、Bs Ab1-Ig G1、BY-27632体内s Ab2-Ig G1、Bs Ab2-SI(ADCC增强亚型);(2)Bs Ab1、Bs Ab2、Bs Ab3均能够与PD-1和CTLA-4特异性的结合,其中Bs Ab1与CTLA4及PD-1的亲和力相对最高。(3)Bs Ab1、Bs Ab2、Bs Ab3在体外均能阻断PD-1与PD-L1、CTLA4与CD80/86的结合;(4)Bs Ab1、Cloning and Expression VectorsBs Ab2、Bs Ab1-Ig G1、Bs Ab2-Ig G1、Bs Ab2-SI均能与CHO-S-h CTLA4和CHO-S-h PD-1细胞系结合(5)Bs Ab1、Bs Ab2、Bs Ab3能有效抑制结肠癌细胞的生长,但Bs Ab1、Bs Ab3并没有展现出优于阳性对照Keytruda类似物的药效活性,只有Bs Ab2在4 mg/kg给药剂量下优于等摩尔给药剂量的Keytruda类似物。(6)对不同抗体亚型进行研究,发现具有Fc效应功能的Ig G1亚型体内药效更优(p<0.01),进一步通过肿瘤浸润淋巴细胞分析发现Bs Ab2-Ig G1明显增加了细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的百分率(p<0.05),显著降低了肿瘤浸润调节性T(Treg)细胞百分率(p<0.01),使肿瘤免疫微环境更有利于杀伤肿瘤。而增强ADCC活性的Fc突变体亚型Bs Ab2-SI则不能进一步提高抗肿瘤活性。结论:无Fc效应功能的Bs Ab1、Bs Ab2、Bs Ab3在体外均能有效的阻断PD-1与PD-L1、CTLA4与CD80/86的结合,其中Bs Ab2阻断CTLA4/CD80/86相互作用的活性相对Bs Ab1及Bs Ab3更强;Bs Ab1、Bs Ab2、Bs Ab3均可以抑制肿瘤的生长Imidazole ketone erastin,但并没有展现出显著的优于阳性对照Keytruda类似物的药效活性。对不同抗体亚型进行研究,发现具有Fc效应功能的Ig G1亚型体内药效更优,进一步通过肿瘤浸润淋巴细胞分析发现Ig G1亚型可以更好的清除肿瘤浸润淋巴细胞中的Treg,而进一步增强ADCC的Fc突变体亚型则不能带来更好的药效获益。本研究为PD-1/CTLA4双特异性抗体的开发提供了新的思路。