适配体是通过SELEX(systematic evolution of liganBemcentinibds by exponential enrichment)技术筛选得到的能特异性识别目标物的单链核苷酸,具有Watch group antibiotics亲和力高、特异性强和易于修饰等优点,在化学分析、医疗诊断和药物输送等方面发挥着重要作用。虽然适配体传感器不断被开发利用,但其发展仍受限于一些客观因素:一是大部分适配体与目标物的具体识别机理研究存在不足;二是易被生物样本内存在的酶降解,很难在生物样本中稳定地识别靶标,因而在检测应用方面存在一定的局限性。因此,本课题以抗生素中使用较为广泛的卡那霉素的适配体为研究对象,针对上述问题,通过荧光偏振(FP)、等温量热滴定(ITC)和圆二https://www.selleck.cn/products/ABT-263.html色谱(CD)等技术深入探究了“线形适配体-靶标”的识别机理,并基于理论研究拓展出用于食品样品检测的适配体传感器;此外,本研究对卡那霉素的线形适配体进行了环化,以期拓宽适配体在生物样本中的应用价值,并基于适配体与靶标的特定结合位点,以环状适配体为识别元件,实现了对卡那霉素的检测。本课题围绕卡那霉素适配体,具体开展的研究工作有以下三点:1、线形适配体识别卡那霉素的机理研究和检测传感器的构建。以卡那霉素线形适配体为研究对象,对其二级结构进行拟合,确认为茎环结构后进行具体分析。首先利用荧光偏振初步确认靶标的可能结合区域;其次在缩小结合区域范围后,对特定碱基进行定点突变获得多个突变体,由ITC测量并比较突变体和原始适配体的解离常数(Kd),从而确认适配体的关键结合碱基为T7、T8、C13和A15。再次,通过ITC的热力学参数和CD的旋光度分析,确认适配体与靶标结合时的主要驱动力为焓驱动,结合时会导致氢键和π-π堆积作用力的变化。最后,基于荧光共振能量转移原理,分别以报道过的原始适配体(Kd=6.91μmol/L)和突变适配体Kmut3(Kd=2.18μmol/L)为识别元件,构建了一种荧光传感器用于检测卡那霉素。加入的目标物会打开适配体的发夹结构,从而增加5’端的FAM和3’端BHQ1的距离,使淬灭的荧光信号被恢复。构建的适配体和Kmut3的荧光传感器的检测限分别为148 nmol/L和59 nmol/L,在实际牛奶样品中的回收率较好具有良好的实际应用价值。2、利用线形适配体的识别机理指导卡那霉素线形适配体的环化。以原始适配体和突变得到的Kmut3为识别元件,在T4 DNA连接酶的作用下,形成双价环状适配体。经过凝胶电泳分析,发现环状双价适配体在血清中的抗酶促降解时间比原始适配体和Kmut3增加了一倍,从线形适配体的12 h提高到了24 h以上,具有更强的生物样本稳定性。ITC实验结果表明,双价环状适配体比原始适配体有更好的亲和力,Kd从原始的6.91μmol/L降低到了3.88μmol/L;且双价环状适配体的热稳定性更强,解链温度提高了10℃左右。因此,构建的双价环状适配体相比线形适配体具有更好的识别性能。3、以双价环状适配体为识别元件,构建比率比色传感器,用于检测食品和生物样本中的卡那霉素。Cy7染料是一种络合在适配体茎环交接处的特殊染料,与卡那霉素在适配体上的结合位点相同。用靶标置换适配体上络合的Cy7染料单体,使被置换下来的Cy7单体在水相的检测缓冲液中重新回到多聚体形式,从而导致吸光值的信号变化。构建的传感器具有方便快捷,易于操作的优点,其能在1 h内完成所有的检测流程。该比色传感器在0.2μmol/L-2.5μmol/L的范围内有良好的线性关系,检测限为129 nmol/L。分别在牛奶、血清样品中的回收率为95.6%-98.0%和94.00%-104.0%,该方法可用于食品样本和生物样本中卡那霉素的检测。