粗枝云杉(Picea asperata)是一种生长在中国西南地区的常绿乔木,在保持地区水土的稳定、保护生物多样性和维持生态平衡等方面有重要作用。近些年来,云杉落针病(Lophodermium piceae)在西南亚高山地区云杉人工林区普遍发生,严重影响了林区的森林生态平衡、木材产业和生态环境。之前关于云杉对云杉散斑壳防御机制的研究报道,主要集中在致病菌生物学特性和针叶形态结构等方面,近些年随着分子生物学技术的发展,已具备从抗病基因和蛋白质水平揭示粗枝云杉抗病分子机制的条件。其中,病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins)是植物受病原物侵染或非生物因子刺激后产生的一类水溶性蛋白,具有降解细胞壁大分子、降解病原物毒素、抑制病毒外壳蛋白与植物受体分子结合等作用,具有抵御病原菌侵染和增强植物抗性的重要作用。目前PR蛋白共分为17个家族,RP56976试剂PR4蛋白作为其中之一,同样具有抗真菌和抵御病原菌侵染的作用,PR4蛋白的特征是碳端具有一个Barwin结构域,根据氮端是否具有几丁质结合结构域(Chitin-binding domain),可将PR4蛋白分为I类和II类。基于此,本研究以粗枝云杉为试验材料,利用RT-PCR技术克隆获得粗枝云杉P R4(PaPR4-a和PaPR4-b)基因的全长c DNA序列,利用生物信息学软件分析核苷酸和氨基酸序列信息,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,并筛选诱导表达的最适条件,检测重组蛋白的可溶性和抗真菌活性。利用RT-q PCR(Real-time quantitative PCR)检测PaPR4-a和PaPR4-b基因在粗枝云杉感病后的表达水平变化。此外,在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中进行了亚细胞定位实验,并通过遗传转化实验,获得过表达PaPR4-a和PaPR4-b的转基因烟草,检测了转基因植株在感病前后目的基因表达量和过氧化物清除酶活性,进一步验证PR4基因在响应云杉落针病过程中的作用。主要研究结果如下:1.成功克隆并得到了粗枝云杉PaPR4-a(Gen Bank:OL617012)和PaPR4-b(Gen Bank:OL617013)基因的c DNA序列。二者的序列长度分别为471 bp和447 bp,各包含一个完整的开放阅读框(Open reading D-Lin-MC3-DMA分子量frame),分别编码157和149个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明,PaPR4-a序列与北美云杉Barwin家族序列的一致性为99.20%,与北美黄杉PR4的序列一致性为96.00%;PaPR4-b序列与北美黄杉PR4的序列一致性为93.92%,表明PaPR4-a和PaPR4-b属于云杉PR4蛋白家族。2.生物信息学预测结果表明,PaPR4-a和PaPR4-b蛋白存在潜在磷酸化位点和跨膜结构域,且在序列首端存在潜在信号肽位点,属分泌蛋白。结构域预测发现,二者的碳端都具有一个Barwin结构域,氮端均不具有几丁质结合结构域,因此二者属于II类PR4蛋白家族。同源性和系统发育分析可知,它们的蛋白序列与裸子植物PR4蛋白家族序列同源性较高,进化较为保守。3.构建了原核表达载体p ET-32a-PaPR4-a和p ET-32a-PaPR4-b,将其转入感受态细胞BL21(DE3)中并诱导其表达,SDS-PAGE结果表明,在30℃下,用0.2 mmol/L的IPTG诱导5h后PaPR4-a的表达量最高,在20℃条件下,用0.2 mmol/L的IPTG诱导3 h后PaPR4-b的表达量最高。二者均以包涵体的形式存在。4.对收集到的包涵体进行洗涤、溶解和复性后,用His标签蛋白纯化树脂收集复性蛋白。将复性蛋白作用于云杉落针病病原菌菌丝24 h后发现,与对照组相比,实验组菌丝形态出现了异常,内含物发生凝结,由此推断重组蛋白对菌丝的生长和病原菌的侵染有一定的抑制作用。5.RT-q PCR分析表明,当粗枝云杉感染云杉落针病后,与健康针叶相比,感病针叶中的PaPR4-a和PaPR4-b基因的相对表达量出现了上升,表明在云杉受到病原菌侵染时,PaPR4-a和PaPR4-b能对病原菌产生响应,并可island biogeography能具有抵抗侵染的作用。6.构建亚细胞定位载体EGFP-PaPR4-a和EGFP-PaPR4-b,将其转入农杆菌感受态细胞GV3101中,侵染4周龄本氏烟草的叶片,共聚焦显微镜下观察发现,PaPR4-a和PaPR4-b均定位在细胞核和细胞膜上。7.为了验证PaPR4-a和PaPR4-b的功能,构建了植物过表达载体OE-PaPR4-a和OE-PaPR4-b,通过遗传转化实验,获得了过表达PaPR4-a和PaPR4-b基因的转基因烟草。结果表明,当转基因烟草受云杉落针病病原菌侵染后,PaPR4-a和PaPR4-b基因的表达水平出现显著上升,较野生型相比,转基因植物体内的过氧化物清除酶活性也出现了显著提高,并表现出抗病性。以上结果表明,PaPR4-a和PaPR4-b可调控过氧化物清除酶网络,增强植物的抗病性。