小麦白粉病是由活体营养专性寄生真菌布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tGNE-140临床试验ritici,Bgt)侵染引起的真菌性病害,近年来在我国发展日益严重,造成了极大的经济损失。选育优良抗病品种是防治白粉病最经济有效途径。本实验室发现高大山羊草(Ae.longissima Schweinf.&Muschl.)(2n=2x=14,S~lS~l)3S~l#2染色体上含有抗白粉病基因Pm13a,并通过诱导中国春-高大山羊草染色体易位系,将Pm13a导入了普通小麦。在此基础上,通过将分子标记开发、小片段易位系创制、转录组测序等技术相结合,对Pm13a进行了精细定位、候选基因发掘和验证,并对Pm13基因的功能进行了初步分析。同时,通过等位性测验﹑抗谱分selleck化学析和基因序列分析,确定了Pm13a和Pm13属于同一个基因。主要研究结果如下:1、抗性丧失突变体创制:用EMS诱变方法筛选出15个M_2株系的Pm13a感病突变体,然后利用分子标记及染色体原位杂交技术进行真实性鉴定,最终筛选到了11个真实的抗性丧失突变体。2、3S~l#2特异分子标记开发:根据3S~l#2/3B二体代换系TA3575转录组测序开发了26个位于高大山羊草3S~l#2染色体不同区段的特异分子标记;通过高大山羊草3S~l染色体短臂0-10 Mb区间的参考基因组序列开发了14个和Pm13紧密连锁的分子标记。共获得特异分子标记40个。3、Pm13a基因定位:构建了部分同源染色体高频重组诱导基因(ph1b)纯合基因型背景的3S~l#2 F_2分离群体,结合抗病鉴定和分子标记分析,得到了26种不同类型的重组体,将Pm13a定位在3S~l#2短臂末端分子标记CL10208和CL56281之间小于3.67 Mb区间。然后,用较小片段的抗病重组体自交构建次生分离群体,再次得到了20种类型重组单株,进一步将Pm13a进一步定位在分子标记3Sl-44661和3Sl-31B之间约124.43 kb物理区段。4、Pm13a基因定位与克隆:根据Pm13a基因定位结果,结合转录组测序和高大山羊草参考基因组序列,共挖掘出6个候选基因。其中抗病类基因有3个,分别为NLR基因,CRK基因和MLKL-ATPK基因。通过对这几个基因进行表达量和序列分析,确认MLKL-ATPK基因(暂命名Ael MLKL)为Pm13a最佳候选基因。再经过抗性丧失突变体的基因全长测序﹑BSMV-VIGS诱导基因沉默和小麦转基因表达等功能验证,确定了Ael MLKL就是Pm13a。Pm13a基因长6413 bp,包含7个外显子,编码序列(CDS)为1431 bp。经过蛋白序列预测,该基因编码476个氨基酸组成的蛋白质,包含一个MLKL-NTD结构域和一个功能性激酶(STPK)结构域。这种抗病蛋白目前在所有其他植物抗病基因中都未曾报道过。5、Pm13的基因关系分析:对不同高大山羊草来源的Pm13a、Pm13b和Pm13进行了抗谱分析﹑基因等位性分析以及g DNA序列分析,证实Pm13、Pm13a和Pm13b是同一个基因。6、Pm13基因功能初步分析:取3S~l#2/3B二体代换系TA3575幼苗期接菌前后不同时段,以及不同部位组织通过荧光实时定量进行Pm13基因表达量测genetic counseling定,发现Pm13基因在接菌后表达量上升,在18 h时表达量最高,然后缓慢下降;Pm13在所有的组织中都有表达,但叶中的表达远高于其他部位。此外,在接种小麦白粉菌后,TA3575叶片中的所有PR基因表达量都显著高于CS,表明Pm13可以触发白粉病防御通路;用Pm13编码序列(CDS)构建绿色荧光蛋白基因(GFP)表达载体并转入小麦原生质体中进行亚细胞定位,发现Pm13在细胞核和内膜系统中均有表达。7、Pm13功能标记开发及微小片段重组体创制:根据Pm13基因序列开发了两个功能标记Ael MLKL-1和Ael MLKL-8,这两个标记可以作为诊断型功能标记,用于Pm13的分子标记辅助选择。另外,创制了Pm13微小片段易位系,其中W12-3的3S~l#2染色体片段小于2.8Mb,仅占高大山羊草3S~l染色体全长的0.35%,可以有效减少Pm13可能产生的不良连锁,在小麦抗白粉病育种有很大应用价值。