1型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1)是引起鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis)的主要病原体,主要导致感染雏鸭的肝脏出血性病变且死亡率极高。DHAV-1属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)。小RNA病毒需要借助宿主蛋白来调控自身增殖。本研究对宿主因子核不均一核糖核蛋白K(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K,hnRNPK)调控DHAV-1的复制进行研究,主要结果如下:1.DHAV-1感染对hnRNPK的影响蛋白质免疫印迹(Western Blotting,WB)试验检测DHAV-1感染对hnRNPK表达的影响,结果表明感染DHAV-1后,鸭胚成纤维(Duck embryo fibroblast,DEF)细胞中hnRNPK蛋白表达水平显著升高;间接免疫荧光(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)和核质分离分析发现DHAV-1感染后部分hnRNPK蛋白能够从细胞核穿梭到细胞质中,与DHAV-1基因组在细胞质内共定位。2.hnRNPK对DHAV-1复制的影响小RNA病毒的生命周期在细胞质中完成,推测hnRNPK出核参与调控DHAV-1的生命周期。分别利用WB和RT-qPCR检测DEF细胞过表达或敲低hnRNPK后病毒蛋白VP3的表达和病毒基因组拷贝数,结果显示过表达hnRNPK可促进DHAV-1病毒蛋白VP3的表达和病毒基因组RNA的复制(P<0.001);而特异性沉默内源性hnRNPK的表达则抑制DHAV-1病毒蛋白VP3的表达和病毒基因组RNA的复制(P<0.0001)。表明hnRNPK是DHAV-1复制相关的正调控因子。3.hnRNPK与DHAV-1 RNA相互作用DHAV-1感染过表达hnRNPK的DEF细胞,24 h后收集样品进行RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)检测,结果显示hnRNPK-His的标签抗体能下拉DHAV-1基因组RNA,表明hnRNPK与DHAV-1selleck产品基因组RNA之间存在相互作用。进一步利用凝胶迁移试验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)发现,体外转录得到的DHAV-1 5’非编码区的核糖体进入位点(Internal ribosome entry siteGSK J4体内,IRES)RNA或3’非编码区(3’UTR)RNA与hnRNPK蛋白共孵育后,hnRNPK蛋白可与其结合形成RNA-蛋白质复合物;利用RNA pull-down试验再次验证DHAV-1 IRES RNA或3’UTR RNA与hnRNPK蛋白的结合情况,结果DHAV-1 IRES RNA、3’UTR RNA均可下拉hnRNPK蛋白。上述结果表明,hnRNPK与DHAV-1非编码区存在特异性相互作用。4.DHAV-1非结构蛋白3CD、3D影响hnRNPK的机制采用WB筛选促进hnRNPK蛋白表达的病毒蛋白,将DHAV-1各结构蛋白和非结构蛋白真核表达质粒转染至DEF细胞,结果表明结构蛋白VP0和非结构蛋白2BC、2B、3CD、3D均能上调hnRNPK蛋白的表达。鉴于3CD、3D蛋白在小RNA病毒复制中起重要作用,本研究选择3CD、3D蛋白进行后续试验。分别将pCAGGS-3D-HA、pCAGGS-3CD-HA与pCAGGS-hnRNPK-His真核表达质粒共转染HEK293T细胞,24 h后收集样品进行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和IFA检测,结果3CD-HA或3D-HA的标签抗体能下拉hnRNPK蛋白,表明hnRNPK与3CD、3D蛋白之间存在相互作用;同时,单独转染定位于胞核的hnRNPK在与3CD或3D共转染DEF细胞后部分出核,与3CD、3D共定位于细胞质,提示3CD、3D蛋白可能在调控hnRNPK出核方面起重要作用。构建marine biofoulinghnRNPK截短/突变体并与3CD或3D共转染,Co-IP试验检测二者间的相互作用,结果hnRNPK的KH1、KI结构域能与3CD或3D相互作用;将hnRNPK的KH1、KI结构域缺失突变体质粒pCAGGS-hnRNPK_(△1-110)-His、pCAGGS-hnRNPK_(△191-328)-His转染DEF细胞,12 h后感染DHAV-1(MOI=0.01或MOI=0.5),WB和RT-qPCR检测比较转染hnRNPK及其突变体hnRNPK_(△1-110)/hnRNPK_(△191-328)细胞中DHAV-1的拷贝数与VP3表达量,结果hnRNPK_(△1-110)组DHAV-1的VP3表达量和拷贝数与hnRNPK组相同,而hnRNPK_(△191-328)组DHAV-1的VP3表达量和拷贝数在病毒感染后24 h、36 h极显著(P<0.01)低于hnRNPK组,表明缺失KH1结构域的突变体hnRNPK_(△1-110)仍对DHAV-1复制具有促进作用,而缺失KI结构域的突变体hnRNPK_(△191-328)对DHAV-1复制的促进作用减弱。综上,DHAV-1感染及病毒蛋白VP0、2BC、2B、3CD和3D均能上调hnRNPK的表达;hnRNPK与DHAV-1的非编码区相互作用并促进病毒复制;hnRNPK通过其KH1、KI结构域与DHAV-1的3CD、3D相互作用,有助于hnRNPK促进DHAV-1复制且KI结构域是调控DHAV-1复制的重要区域。