果胶裂解酶(EC 4.2.2.2)能够降解果胶类物质,通过β-消除作用断开多聚半乳糖醛酸链的α-1,4糖苷键,在半乳糖醛酸的C5位置生成不饱和双键。果胶裂解酶在造纸、苎麻脱胶、生物精炼以及含果胶废水处理等领域均有广泛应用。其广泛来源于各种植物或微生物,目前已经有多种菌株中的碱性果胶裂解酶实现了异源表达,但对于酶耐碱性机理的研究并不多。本文对果胶裂解酶BspPel进行片段替换,获得最适p H值和比酶活力提高的重组酶,并分析影响耐碱耐热性的关键区域和位点。取得的研究结果如下:1.使用Signal P 5.0信号肽在线预测网站分析来自Bacillus sp.RN1的pel基因的信号肽序列,去掉信号肽后构建pET28a-pel质粒。选择序列相似度>60%、耐碱性强的果胶裂解酶Pel4-N与BspPel的K250-P261 loop区进行同源片段替换,构建工程质粒pET28a-pel-th并在Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达,获得分子量为34.3 k Da的重组蛋白BspPel-th。其比酶活力为27057.5 U/mg,与原始酶相比提高4.4倍,最适p H由10提高至11。动力学模拟显示替换后的loop区具有更强的柔性,且表现出更优良的底物结合能力。2.将特异性结合果胶的碳水化合物结合结构域Ye CBM32与黄色荧光蛋白的A段和B段分别融合,构建质粒pET20b-eyfp A-ye CBM32和pET20b-ye CBM32-eyfp B,并分别转化至E.coil BL21(DE3)中异源表达,实现重组蛋白的表达。优化重组荧光蛋白Eyfp A-ye CBM32和Ye CBM32-eyfp B与果胶结合的比例,建立果Spatholobi Caulis胶裂解酶活力的快速检测体系,发现该体系具有良好的底物特异性,酶活力与筛选体系的荧光强度呈现反比的关系。获得突变体BspPel-th/T250N与BspPel-th/T250R,酶学性质测试发现重组酶的最适温度均提高5℃,热稳定性得到提高,其中BspPelth/T250R的最适p H由11提到至11.5。3.通过序列比对和三维结构分析,基于BspPel-th的L253和G254进行回复突变获得单突变体BspPel-selleckchem NSC 127716th/L253I和BspPel-th/G254V。在60℃孵育1 h后的剩余酶活力分别为71%、66.4%,较BspPel-th分别提高54.8%、50.2%,二者的热稳定性均得到提高。双位点突变后的BspPel-th/L25GSKJ4作用3I-G254V并没有获得热稳定的提高,这说明双位点突变并没有获得功能的叠加效果。突变体BspPel-th/R260S的最适p H由11下降至10.5,结果说明260位精氨酸作为碱性氨基酸对酶分子的耐碱性具有重要作用。