目的:近几年来,拉沙病毒的感染率及死亡率呈现不断攀升趋势,目前仍没有有效的疫苗及治疗药物。天然产物是新药研发的重要来源,挖掘传统药用植物重要的生物活性,对新药的研发具有重要意义。本研究旨在通过构建拉沙病毒的细胞融合模型及其假病毒感染模型,对几种药用植物的粗提物抗病毒活性进行评估,以筛选出具有抗拉沙病毒活性的药用植物提取物,并利用不同谱系拉沙病毒包膜蛋白,构建假病毒及细胞-细胞融合模型,进一步评估候选药用植物提取物的抗病毒活性,并对该提取物抗病毒机制进行初步研究,为抗拉沙病毒药物及抗病毒主要成分的深入研究Panobinostat作用提供理论基础及实验依据。方法:1.利用4个谱系拉沙病毒的细胞-细胞融合模型,建立相应的假病毒感染模型,进行云南松塔、白刺花、紫地榆等三类药用植物提取物的抗病毒活性初步评价和筛选。2.利用293T及Huh-7体外培养评价药用植物提取物的细胞毒性,进一步用细胞融合模型及假病毒感染模型确定抗病毒活性最佳的药用植物提取物,评价其在LASV各谱系中的抗病毒活性。3.为探究白刺花提取物的抗病毒机制,通过LassaⅣ(Josiah)的假病毒感染模型在不同时间点加入白刺花提取物,以初步探究白刺花提取物作用时期。利用LassaⅣ(Josiah)假病毒感染模型作Time of addition实验,进一步研究白刺花提取物作用于病毒感染的哪一阶段,将白刺花提取物与靶细胞预先孵育后除去,再以假病毒感染靶细胞,并将白刺花提取物和假病毒孵育后除去,再以此假病毒感染细胞,以探究白刺花提取物靶向于假病毒还是靶细胞。此外,将白刺花提取物与假病毒共孵育后,以PEG6000沉淀收集假病毒,作Weston-Blot半定量,进一步确认白刺花提取物是否有裂解假病毒作用。结果:1.成功构建p AAV-IRES-GFP-LassaⅠ(LP)、p AAV-IRES-GFP-LassaⅡ(803213)、p AAV-IRES-GFP-LassaⅢ(GA391)和p AAV-IRES-GFP-LassaⅣ(Josiah)重组质粒,转染进入293T细胞后分别成功表达LassaⅠ(LP)、LassaⅡ(803213)、LassaⅢ(GA391)、LassaⅣ(Josiah)型拉沙病毒包膜蛋白基因和绿色荧光蛋白基因。转染后的293T/GFP/LassaⅠ(LP)细胞、293T/GFP/LassaⅡ(803213)细胞、293T/GFP/LassaⅢ(GA391)细胞、293T/GFP/LassaⅣ(Josiah)细胞与Huh-7细胞混合培养12h后,以低p H进行融合启动,相对于阴性对照,30min后,在荧光显微镜下可发现绿色荧光蛋白排布发生明显变化,融合细胞体积增大形成细胞融合体,荧光强度变弱,2h后形成大范围体积更大的细胞融合体,细胞-细胞融合模型构建成功。将LassaⅠ(LP)、LassaⅡ(803213)、LassaⅢ(GA391)、LassaⅣ(Josiah)型拉沙病毒包膜蛋白基因经密码子优化后,分别插入哺乳动物细胞表达载体pc DNA3.1(+)中,获得了重组质粒pc DNA3.1-LassaⅠ(LP)、pc DNA3.1-LassaⅡ(803213)、pc DNA3.1-LassaⅢ(GA391)和pc DNA3.1-LassaⅣ(Josiah)。各重组质粒与HIV慢病毒骨架(p NL4-3.Luc.R-E-)质粒共转染进入293T细胞,72h后获取上清中假病毒颗粒,该假病毒颗粒感染Huh-7细胞后可检测到较高水平酶活,提示假病毒感染模型构建成功。2.利用LassaⅣ(Josiah)细胞-细胞融合模型,检测几种药用植物提取物的融合抑制活性,得Telaglenastat作用到了它们的IC50(半抑制浓度),其中,白刺花提取物:37.19±0.85μg/m L、松塔提取物:83.07±8.95μg/m L、紫地榆(乙酸乙酯部位)提取物:105.89±3.09μg/m L、紫地榆(正丁醇部位)提取物:86.53±10.02μg/m L。利用LassaⅣ(Josiah)假病毒感染模型,检测不同药用植物提取物的抗病毒活性,得到了它们的IC50,其中,白刺花提取物:0.64±0.04μg/m L、松塔提取物:98.71±15.95μg/m L、紫地榆(乙酸乙酯部位)提取物:21.78±2.01μg/m L、紫地榆(正丁醇部位)提取物:19.49±2.94μg/m L。各药用植物提取物对细胞融合模型中的细胞毒性不同,其中,白刺花提取物CC50(半数毒性浓度)值:223.5±6.2μg/m L,而松塔、紫地榆(正丁醇部位)、紫地榆(乙酸乙酯部位)提取物即使药用植物提取物浓度达到500μg/m L,未对细胞产生明显毒害作用。各药用植物提取物对假病毒感染模型中的细胞毒性不同,其中,白刺花提取物CC50值:31.60±2.44μg/m L、松塔提取物CC50值:562.37±10.89μg/m L、紫地榆(乙酸乙酯部位)提取物CC50值:99.48±4.82μg/m L、紫地榆(正丁醇部位)提取物CC50值:312.17±12.01μg/m L。几种药用植物提取物均可以在安全剂量下发挥抗病毒作用。3.候选药物白刺花提取物对拉沙病毒不同谱系也存在抑制效果,其中白刺花提取物对各型病毒融合的IC50分别为LassaⅠ(LP):63.16±7.13μg/m L、LassaⅡ(803213):90.64±14.58μg/m L、LassaⅢ(GA391):46.07±7.02μg/m L。对各型假病毒的IC50分别为LassaⅠ(LP):2.66±1.09μg/m L、LassaⅡ(803213):medullary rim sign1.29±0.42μg/m L、LassaⅢ(GA391):1.58±0.64μg/m L。4.以LassaⅣ(Josiah)作为白刺花提取物抗病毒机制的研究,发现白刺花提取物在假病毒感染的早期发挥其抗病毒效果。Time of addition结果显示白刺花提取物的抗病毒作用在病毒进入阶段,主要在融合阶段发挥效果,且白刺花提取物靶向于假病毒而非靶细胞。将假病毒与白刺花提取物共同孵育后洗涤回收,进行Western Blotting半定量,结果显示孵育后假病毒并未减少,白刺花提取物对LassaⅣ(Josiah)假病毒颗粒不具有裂解作用。结论:1.成功构建基于LassaⅠ(LP)、LassaⅡ(803213)、LassaⅢ(GA391)、LassaⅣ(Josiah)的细胞-细胞融合模型及其假病毒感染模型。四种药用植物提取物均具有抗拉沙病毒活性,白刺花提取物的抗病毒效果最为突出。四种药用植物提取物均能在安全剂量下发挥其抗病毒效果。2.药用植物提取物中的白刺花提取物对拉沙病毒不同谱系均有抗病毒作用,具有广谱抗拉沙病毒效果。3.白刺花提取物作用于拉沙病毒感染的早期,主要在进入阶段中的融合阶段发挥抗病毒效果,且白刺花提取物的抗病毒作用靶向于假病毒。白刺花提取物对拉沙病毒假病毒颗粒不具有裂解作用,可能通过与HR1区中的残基相互作用,从而阻断病毒膜融合过程。