合成生物学使能技术的快速发展为基因组的“改写”提供了大量的遗传操作工具。其中,以CRISPR为基础的基因编辑及其衍生技术对实现该目标起到极大的助推作用。CRISPR-Cas基因编辑技术自2012年诞生以来,已围绕基因删除、插入以及碱基转换等方面形成了一批高效、精准的基因编辑工具。尤其是近年发展起来的碱基编辑技术,对High-Throughput重塑生命功能起到了不可替代的作用。最近,建立在经典的CRISPR-Cas系统上的各种碱基编辑系统不断被创制出来,并与真核和原核等各类底盘细胞进行适配,开展了在基因治疗、工业菌株改造、作物抗逆等诸多重要的领域的应用探索。工业菌种的设计和改造是碱基编辑技术的一个重要应用领域,目前已有多种不同类型的碱基编辑系统用于工业菌株代谢调控、功能基因改造等方面。在应用的过程中,也发现了诸多的瓶颈问题,诸如编辑效率低、编辑窗口窄、编辑效率可调性差以及突变多样性少等。基于此,开发效率高且可调、编辑窗口宽的基因编辑系统,将进一步促进微生物合成生物学的研究发展及“智能化底盘”细胞的快速构建。本研究以CRISPR系统为研究对象,在B.subtilis中构建了两类基于CRISPR-Cas的高效、便携的基因和碱基编辑系统。并验证了上述系统在内源性蛋白的原位进化及高版本底盘细胞构建上的可行性和有效性。主要研究结果如下:(1)构建了基于CRISPR-Cas12a的三种基因组编辑系统,并验证了这些系统在单基因以及多基因删除,超长基因簇删除,单基因插入的高效性。首先,在B.subtilis中异源重构了基于CRISPR-Cas12a的单质粒编辑系统(All-in-one,AIO),以B.subtilis内源基因sac A、lac A以及lig DV为例考察其删除能力,效率均为100%;以异源基因sfgfp为例,考察了AIO系统对其插入的能力,效率为9%。然后,在B.subtilis中构建了基于CRISPR-Cas12a的双质粒编辑系统(Two-Plasmids,TP)。利用该系统对基因sac A和lac A进行编辑,结果显示删除效率分别高达100%和91%。最后,在B.subtilis中异源重构了一种基于CRISPR-Cas12a的整合型编辑系统。其对内源基因sac A、bac operon、pps operon的删除效率分别为100%、100%、80%;对外源基因sfgfp的插入效率为82%;对双基因(sac A和apr E)同时删除的效率为58%。该三种基因组编辑系统可以适合于不同的应用场景,显示出极高的编辑效率。(2)构建了可编程的胞嘧啶碱基编辑系统CRISPR-CDA-nCas9-UGI,并成功将该系统应用于膜蛋白和蛋白复合体的原位进化。利用Petromyzon marinus来源的胞嘧啶脱氨酶Pm CDA(简称CDA)和Streptococcus pyogenes来源的CRISPR-Cas9在B.subtilis中设计并构建了胞嘧啶碱基编辑系统CRISPR-CDA-nCas9,考察了碱基编辑效率、编辑窗口以及编辑效率的可调性。通过对sg RNA进行改造以及添加Uracil DNA glycosylase inhibitor(UGI)进一步提升了窗口内可编辑位点的编辑效率并且拓宽了编辑窗口。在此基础上,设计并构建了基于CRISPR-CDA-nCas9-UGI的多基因编辑系统,并验证了该系统的高效及可调控特点。借助CRISPR-CDA-nCas9-UGI碱基编辑系统,对膜蛋白Bce B和蛋白复合体Sec YEG进行了原位进化,并成功筛选到了蛋白分泌效率大幅提高的突变体。(3)设计并构建了基于CRISPR的双脱氨酶碱基编辑系统,实现对底盘功能基因的原位改造,提升了底盘对抗菌活性肽的抗逆性。将胞苷脱氨酶CDA、高活性的腺苷脱氨酶ABE8e以及nCas9(D10A)融合后,在B.subtilis中构建了可编程的双脱氨酶碱基编辑系统CRISPR-ABE8e-CDA-nCas9,以sig E作为靶基因进行编辑,显示该系统具备极高的A-to-G和C-to-T的编辑效率。选择bceB和pks operonTezacaftor供应商作为靶标的编辑结果显示该系统对基因编辑具有普适性,并且可实现多基因的同时编辑,编辑窗口为8～11nt。在此基础上,考察了CRISPR-ABE8e-CDA-nCas9编辑效率的可调性,适用于突变体文库的构建。借助该系统,对B.subtilis中内源的PsdB蛋白进行了突变体文库的构建,成功筛选到了对nisin抗性提高的高版本细胞。(4)对最近发现的Cas12b蛋白进行改造,成功获得了催化活性缺陷的打靶蛋白d Cas12b(catalytically deactivated Cas12b),并在此基础上构建出了CRISPRi系统和碱基编辑系统。基于Bacillus hisashii来源的Cas12b,设计并创制了基于CRISPR-Cas12b的单质粒基因删除系统,其对sac A和apr E的删除效率均为100%;通过对不同来源Cas12b进行序列比对以及分子对接,找到了3个影响Cas12b核酸酶活性的关键位点(D574、E828以及D952),通过基因突变获得核酸酶失活突变体,该突变体保留和sg RNA的结合selleckchem能力。在此基础上开发了基于d Cas12b的CRISPRi系统,以e GFP和6种启动子作为靶标对象考察了其弱化基因的水平。此外,设计并发展了基于d Cas12b的CBE系统,其能够在一个宽泛的编辑窗口内(～16 nt)实现C到T的转换。综上,本论文以CRISPR系统为研究对象,在重要的工业底盘B.subtilis中构建了基于CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a以及CRISPR-Cas12b的基因和碱基编辑系统。成功解决了基因编辑系统在细菌底盘中存在的编辑效率低、可调性差、编辑窗口窄等问题。此外,本研究开发的BE系统还拥有编辑效率可调、编辑窗口宽等特点,这些特点能够对基因组进行大范围扫描从而构建多样化突变文库,加速了“定制”微生物底盘的设计与构建。