肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis,SE)是重要的人兽共患病原菌,可以通过多种途径在不同宿主间传播,引发腹痛、腹泻等胃肠道疾病,严重的会导致宿主休克甚至死亡。肠炎沙门菌能够凭借复杂的免疫逃逸机制躲避宿主免疫系统的清除,实现在宿主体内的长期定植,造成持续性感染。沙门菌致病力与宿主免疫应答能力的相互抗衡不断影响持续性感染的进程,但肠炎沙门菌引发持续性感染的关键因子有待于进一步研究。基于此,本研究利用Tn-seq技术筛选肠炎沙门菌Z11菌株引发持续性感染的关键基因,分别在细胞和动物模型上探索这些基因对沙门菌持续性感染的影响,为深入探究肠炎沙门菌逃避宿主免疫应答建立持续性感染的机制提供了关键靶点。1筛选肠炎沙门菌持续性感染相关基因本研究以肠炎沙门菌Z11菌株为研究对象,以1×108 CFU剂量口服感染129 S2/SvE小鼠,建立持续性感染模型。分别在不同时间点观察小鼠肝、脾、胆囊、盲肠和派尔氏结等5种脏器中肠炎沙门菌的定植情况,结果表明Z11菌株主要定植在盲肠和派尔氏结中,少部分能https://www.selleck.cn/products/cb-839.html够突破肠上皮细胞屏障扩散至肝、脾和胆囊等部位。因此,后续实验选取盲肠和派尔氏结作为研究对象,利用Tn-seq技术筛选Z11菌株持续性感染相关基因。构建Z11菌株高丰度转座子插入突变体库作为初始文库,以1×108 CFU剂量口服灌胃小鼠,于感染后不同时间点提取盲肠和派尔氏结中沙门菌基因组作为回收文库。获得37份有效样品进行基因组打断、末端修复磷酸化加A及PCR扩增以构建高通量测序文库。根据Tn-seq结果,筛选到KMIPBBJO_01249、fadB等11个基因可能对Z11菌株持续性感染后期盲肠中的定植有重要作用,而在派尔氏结中并未发现与感染后期密切相关的基因。此外,本研究也筛选发现csrA等43个基因可能与Z11菌株在盲肠和派尔氏结中的早期定植密切相关。2持续性感染候选基因生物学鉴定为探究不同基因在Z11菌株引发持续性感染过程中的作用,我们选取KMIPBBJO_01249、fadB等9个基因构建框内无标记缺失突变株,并进行生物学鉴定。与野生株(WT)相比,所有缺失突变株的生长能力均无显著差异。运动性结果显示,ΔKMIPBBJO_01249、ΔfadB、ΔassT_4和ΔnrdE的游动能力显著低于WT,表明这些基因能够影响Z11菌株的运动能力。此外,本研究测定了不同缺失突变株对RAW 264.7细胞的细胞毒性、黏附侵袭和胞内增殖能力。结果显示ΔfadB对巨噬细胞的细胞毒性较WT显著降低,ΔKMIPBBJO_01249和ΔfadB侵袭能力显著低于WT,表明KMIPBBJO_01249和fadB可以影响Z11菌株的侵袭能力及对宿主细胞的细胞毒性。fadB基因编码脂肪酸β氧化多酶复合体,参与沙门菌对脂肪酸的利用,因此本研究考察了以不同脂肪酸为唯一碳源时,沙门菌不同缺失突变株的生长情况。结果显示,以辛酸钠(C8)为唯一碳源时,ΔfadB生长能力受到明显抑制,表明FadB通过促进Z11菌株对宿主体内辛酸钠等脂肪酸Medidas posturales盐的利用,为肠炎沙门菌的肠道定植提供有利条件。以129 S2/SvE小鼠为模型,考察Z11、ΔKMIPBBJO_01249和ΔfadB体内持续性感染情况,结果发现在感染初期小鼠盲肠中ΔfadB载菌量较WT显著上升,感染后期ΔfadB载菌量显著低于WT,表明FadB通过影响Z11菌株肠道定植能力参与持续性感染的进程。感染初期ΔKCL 318952说明书MIPBBJO_01249在小鼠盲肠中的定植能力显著低于WT,而派尔氏结中的载菌量显著高于Z11菌株,但在感染后期均未出现显著差异。盲肠、派尔氏结的组织病理切片观察,发现小鼠盲肠组织病变严重,出现大量溃疡,肠腺坏死消失,固有层及黏膜下层可见较多淋巴细胞和粒细胞散在浸润,派尔氏结中病变程度随感染进行而加重,但不同菌株感染组之间无显著差异。