背景:阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease此网站,AD)是一种以β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积和神经元损伤为主要病理特征的神经退行性疾病。临床上虽有药物用于治疗AD,但仍不能满足人们的需求。杨梅素是一种天然黄酮类化合物,研究发现其具有神经保护作用,可抑制AD动物模型海马CA3区神经元损伤,改善学习记忆障碍。目的:以3×Tg-AD小鼠为AD动物模型探讨杨梅素对AD潜在的治疗作用并深入研究杨梅素防治AD的作用机制。方法:(1)研究选用8月龄C57BL/6J小鼠和相同月龄的3×Tg-AD小鼠,并将其分为5组:野生对照组(WT-Veh)、模型组(3×Tg-AD-Veh)、杨梅素给药组(3×Tg-AD+Myr 10 mg/kg,3×Tg-AD+Myr 20 mg/kg)、阳性药对照组(3×Tg-AD+Donepezil1 mg/kg)。以腹腔注射的方式进行小鼠杨梅素的给药,野生对照组,模型组和阳性药对照组分别以相同的溶剂及阳性药物进行腹腔注射,以上给药周期为21天。同时选用BV2细胞,使用Aβ_(25-35)诱导BV2细胞构建体外AD模型,并使用P38 MAPK信号通路激动剂脱氢紫堇碱(Dehydrocorydaline,DHC)进行分子机制验证。设6个实验组:正常对照组(Con),溶剂处理的BV2细胞;正常对照+给药组(Con+Myr);Aβ诱导模型组(Aβ_(25-35) 10μmol/L);模型+给药组(Aβ_(25-35) 10μmol/L+Myr 50μmol/L);模型+激动剂对照组(Aβ_(25-35) 10μmol/L+DHC 10μmol/L);模型+激动剂+给药组(Aβ_(25-35) 10μmol/L+DHC 10μmol/L+Myr 50μmol/L)。(2)在小鼠给药结束后进行水迷宫实验,评估小鼠的空间学习记忆能力;以尼氏染色法观察小鼠脑组织石蜡切片中海马与皮层区神经元的损伤情况;硫磺素S染色法观察小鼠脑组织石蜡切片中Aβ负荷;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测皮层与海马中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-4(inteMedial prefrontalrleukin-4,IL-4)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的含量;免疫荧光染色检测小鼠皮层区Iba1、Arg1、CD16的表达情况;网络药理学、分子对接技术及细胞热迁移实验(Cellular Thermal Shift Assay,CETSA)研究杨梅素与P38的结合情况;线粒体膜电位检测试剂盒检测BV2细胞的线粒体膜电位;Western-blot法检测小鼠皮层与海马组织以及细胞中p-P38、线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1,FIS1)、动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)、视神经萎缩1(optic atrophy 1,OPA1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,NRF1)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor therSmoothened Agonist细胞培养mal protein domain associated protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、小胶质细胞标志物Iba1(ionized calcium-binding adapter molecule1,Iba1)、M2型小胶质细胞标志物Arg1、M1型小胶质细胞标志物CD16、突触后密度蛋白(postsynaptic density protein-95,PSD95)、突触素(recombinant synaptophysin,SYP)的蛋白表达情况。结果:(1)杨梅素改善3×Tg-AD小鼠认知功能障碍的药效学研究。在Morris水迷宫实验中,经过5天的训练,各组小鼠呈现出不同程度的学习能力。与WT组相比,3×Tg-AD小鼠抵达平台的潜伏期显著增长,而杨梅素给药组小鼠的潜伏期比3×Tg-AD小鼠要短。当测试平台被隐藏时,3×Tg-AD小鼠表现无目的的搜寻策略,接受杨梅素给药后的小鼠在目标象限花费的时间以及目标象限的运动距离比例更大,穿越平台位置的次数与多奈哌齐阳性药组相似且效果接近于WT组。尼氏染色结果显示,与WT组相比,3×Tg-AD组小鼠脑部神经元细胞结构混乱,尼氏体染色较浅,CA3和皮层区域的细胞形态发生变化,这些情况在杨梅素给药后得到了改善,主要表现为尼氏体排列恢复紧密,空泡化现象减少;硫磺素S染色结果显示,与3×Tg-AD小鼠相比,杨梅素给药后小鼠脑部的Aβ斑块数量明显减少;Western blot检测结果显示,与WT小鼠相比,3×Tg-AD小鼠大脑中PSD95和SYP的表达减少,给药杨梅素后明显提高了PSD95和SYP的蛋白水平。(2)杨梅素靶向抑制3×Tg-AD小鼠脑中P38 MAPK通路的激活。网络药理学及分子对接的结果表明杨梅素可作用于多个靶点调控MAPK信号通路且杨梅素与P38进行对接,产生-7.4 kcal/mol的结合能,表明杨梅素能与P38稳定结合。CETSA实验结果揭示,有无杨梅素时,P38的变性温度相差52-61℃,表明杨梅素可以直接与P38结合。Western blot检测结果显示,3×Tg-AD小鼠皮层和海马区P38磷酸化水平显著高于WT组。这一结果表明,P38 MAPK信号通路在小鼠模型中被激活,但给予杨梅素后,该通路受到抑制。(3)杨梅素恢复3×Tg-AD小鼠脑组织线粒体动力学平衡并促进线粒体生物发生。Western blot检测结果显示,在3×Tg-AD小鼠海马以及皮层区,FIS1、DRP1表达明显高于WT组小鼠,而OPA1、MFN2表达降低,表明该模型中线粒体分裂与融合之间的动态平衡被打破。此外,实验发现3×Tg-AD小鼠脑组织中NRF1、TFAM蛋白表达水平显著降低,这说明线粒体生物发生过程异常。在给药杨梅素后,以上结果发生了逆转,提示杨梅素可有效恢复3×Tg-AD小鼠脑组织中线粒体分裂与融合之间的动态平衡并促进线粒体生物发生。(4)杨梅素抑制NLRP3炎性小体激活。Western blot结果显示,3×Tg-AD小鼠皮层和海马组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18的表达明显高于WT组小鼠,提示3×Tg-AD小鼠脑组织中NLRP3炎性小体被激活,值得注意的是,杨梅素给药降低了以上四种蛋白的表达,提示杨梅素抑制了NLRP3炎性小体的激活。(5)杨梅素抑制小胶质细胞过度激活并促进小胶质细胞M1型向M2型转化。免疫荧光实验及Western-blot实验发现,3×Tg-AD小鼠皮层和海马中小胶质细胞标志物(Ib a1)和M1型标志物(CD16)的表达明显增多且M2型标志物(Arg1)表达减少,在给予杨梅素后,以上情况均出现逆转,提示杨梅素能显著抑制3×Tg-AD小鼠的小胶质细胞过度激活并促进小胶质细胞M1型向M2型转化。(6)杨梅素改善3×Tg-AD小鼠神经炎症。ELISA结果显示,与3×Tg-AD组相比,3×Tg-AD+Myr 20 mg/kg组小鼠促炎因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)的水平明显降低且抗炎因子(IL-4、IL-10)升高,表明杨梅素可有效改善3×Tg-AD小鼠的神经炎症。(7)杨梅素抑制体外AD模型中P38 MAPK信号通路的激活。在体外实验中,使用Aβ_(25-35)诱导BV2细胞构建体外AD模型,并使用P38 MAPK信号通路激动剂DHC进行分子机制验证。Western blot检测结果显示,杨梅素可有效抑制Aβ_(25-35)诱导所致的P38过度磷酸化。而DHC进一步加剧P38磷酸化,促进P38 MAPK信号通路的激活。(8)杨梅素靶向P38 MAPK信号通路调控线粒体-NLRP3炎性小体-小胶质细胞途径。Western blot结果提示,杨梅素可通过抑制P38 MAPK信号通路的激活,恢复BV2细胞中Aβ_(25-35)诱导所致的线粒体动力学失衡,促进线粒体生物发生。JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测结果显示,杨梅素能通过抑制P38 MAPK信号通路的激活促进线粒体膜电位的恢复,改善体外AD模型中线粒体功能障碍。根据上述结果,在体外AD模型中对NLRP3炎性小体的激活情况进行检测。结果表明,杨梅素可以通过抑制P38 M APK信号通路的激活来抑制Aβ_(25-35)诱导所致的线粒体功能障碍,从而抑制NLRP3炎性小体的过度激活。此外,Western blot实验结果还发现,杨梅素可以通过抑制P38 MAP K信号通路的激活,抑制Aβ_(25-35)诱导所致的线粒体功能障碍,抑制NLRP3炎性小体过度激活,从而抑制小胶质细胞的过度激活并促进小胶质细胞由M1型向M2型转化。结论:杨梅素能减轻3×Tg-AD小鼠脑部Aβ负荷,抑制神经元和突触损伤,改善小鼠认知功能障碍,其机制可能是通过靶向P38 MAPK信号通路调节线粒体-NLRP3炎性小体-小胶质细胞途径抑制神经炎症的产生。因此,我们的研究支持杨梅素作为AD的潜在候选药物进一步开发。