蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)主要由颅内动脉瘤破裂出血引发,是神经外科常见的危急重症之一。由于其发病突然、病情凶险,所以对患者危害性较大,常常导致患者的残疾甚至死亡。SAH后脑损伤的病理生理机制复杂,其中迟发性脑血管痉挛(cerebral vasospasm,CVS)和早期脑损伤(Early brain injury,EBI)是 SAH 患者通常要面临的两个主要并发症,是其致残、致死的重要原因。为了减轻SAH后的脑损伤,有效改善患者的不良预后,数十年来研究人员进行了大量的临床和基础的研究工作。在研究的初期,人们把注意力都集中在迟发性脑血管痉挛的预防和治疗上,认为血管痉挛主导了 SAH后神经功能障碍和脑损伤。然而一项针对脑血管痉挛的多中心的随机双盲临床研究结果显示,即使CVS得到很好控制,SAH患者的预后并没有得到明显的改善。基于这个研究结果人们推测,在SAH后除了 CVS外还存在着其它可以导致患者预后不良的神经功能损伤机制。近年SAH后早期脑损伤(EBI)逐渐受到人们的重视,即从SAH开始至72小时这一时间段之内发生的脑损伤。研究发现早期脑损伤可能是引发SAH后继发性神经功能障碍和导致预后不良的重要因素。既往的研究表明微血栓形成在动脉瘤性SAH后的不良预后中起到了重要作用,血栓性微血管的数量与血脑屏障的破坏、神经元细胞凋亡和微循环障碍密切相关,但目前对SAH后微血栓形成的具体机制尚不清楚。因此以微血栓形成为靶点可能为SAH后脑损伤的治疗提供新的思路。中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞发挥功能的重要方式之一。当中性粒细胞受到外界各种刺激活化以后,便会通过不同的方式将细胞核染色质释放到细胞外环境中形成高浓度网状DNA复合物。网状复合物以染色质DNA为主要骨架,上面黏附着多种酶和抗菌蛋白。当机体受到外源性感染侵袭时NETs可以有效的捕获病原微生物,发挥抗感染作用。此外,研究还发现在多种非感染性疾病的病理进程中NETs也发挥着重要作用,如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、肾脏损伤、肿瘤性疾病等。近年来,在多种中枢神经系统疾病的病理进程中也发现了 NETs的身影,如在缺血性脑卒中和创伤性颅脑损伤中用使用DNase Ⅰ降解NETs改善了神经功能;在SAH后的早期脑损伤中NETs也起到了重要作用,SAH后中性粒细胞释放的NETs可诱导小胶质细胞改变为促炎性亚型,从而促进神经炎症并导致不良后果。促凝、诱导微血栓形成是NETs发挥损伤作用的重要机制之一。研究表明缺血性脑卒中后微血栓形成和NETs密切相关,同时NETs的生成也是新型冠状病毒肺炎患者血液高凝及肺部微血栓形成的重要因素。基于已有的研究成果我们推测NETs可能在SAH后微血栓的形成中也发挥重要作用。本研究聚焦于探索NETs在SAH后早期微血栓形成和早期脑损伤中的作用和机制,以期为SAH后早期脑损伤的临床治疗寻找新的有效靶点。第—部分:实验性小鼠SAH后脑组织中的NETs的表达变化及和微血栓的关系目的:观察NETs在小鼠SAH后不同时间点大脑皮层组织中的表达,并初步研究其和微血栓之间的相互关系。方法:本研究共分为二个部分。第一部分,采用颈内动脉血管内穿刺的方法建立小鼠SAH模型,研究分为2组:假手术组(Sham组)和蛛网膜下腔出血组(SAH组)。蛛网膜下腔出血组根据时间的先后顺序再分为4个组:SAH后4小时组,SAH后12小时组,SAH后24小时组,SAH后48小时组。SAH模型建立后在相应的时间点处死小鼠,提取颞叶皮层组织蛋白行Western blot 检测 NETs 的表达。第二部分,采用颈内动脉血管内穿刺的方法建立小鼠SAH模型,研究分为2组:假手术组(Sham组)和蛛网膜下腔出血组(SAH组)。SAH后24小时处死小鼠,取脑组Regorafenib MW织通过免疫荧光染色观察NETs和微血栓的生成及二者之间的位置关系。结果:1.Western blot检测发现与Sham组小鼠相比,SAH组小鼠大脑皮层NETs的表达在出血后4小时即有明显升高,24小时达到顶峰,随后开始下降。2.小鼠脑组织冰冻切片免疫荧光染色结果显示,SAH后24小时小鼠大脑皮层组织微血管内可见大量微血栓形成,血管外间隙中也可见部分微血栓形成,微血栓和NETs共定位。结论:SAH后小鼠大脑皮层中NETs生成明显增加,同时还有大量微血栓形成。免疫荧光染色显示NETs和微血栓在大脑皮层中共定位,提示NETs可能参与了小鼠SAH后大脑皮层中微血栓的形成。第二部分:NETs在小鼠SAH后微血栓形成和微循环障碍中的作用和机制研究目的:在第一部分研究的基础上,观察SAH后抑制NETs生成对小鼠大脑皮层微血栓形成、神经功能损伤、脑含水量、血脑屏障破坏、神经元细胞凋亡及微循环障碍等相关指标的影响。进一步阐明NETs在SAH后微血栓形成和早期脑损伤中的作用和机制。方法:本研究共分为三个部分。第一部分,采用颈内动脉血管内穿刺法建立小鼠SAH模型,MRTX849 NMR研究分为3组:假手术组(Sham 组),溶剂组(SAH+Vehicle 组),anti-Ly6G 抗体干预组(SAH+anti-Ly6G组)。SAH+anti-Ly6G组小鼠造模前24小时尾静脉注射anti-Ly6G抗体,5μg/g体重,SAH+Vehicle组注射相应体积的生理盐水。24小时后对小鼠进行神经功能评分;随后麻醉小鼠从左心抽取动脉血液行血常规检测。然后迅速断头,完整剥离脑组织后行SAH出血量评分;采用干湿重法检测脑组织含水量;Western blot检测脑组织CitH3及血脑屏障相关蛋白的表达;通过测定脑组织伊文氏蓝(EB)含量评价不同组小鼠血脑屏障通透性;免疫荧光染色观察小鼠脑组织NETs及微血栓的生成情况;通过FJC及TUNEL染色观察小鼠SAH后神经元细胞的损伤和凋亡凋况。第二部分,采用颈内动脉血管内穿刺法建立小鼠SAH模型。研究分为3组:假手术组(Sham 组),溶剂组(SAH+Vehicle 组),DNase Ⅰ 干预组(SAH+DNase Ⅰ 组)。SAH+DNase Ⅰ组在造模成功后1小时后给腹腔及静脉注射DNase Ⅰ,SAH+Vehicle组注射相应体积的生理盐水。模型建立后24小时对小鼠进行神经功能评分;随后麻醉小鼠,断头取脑后行SAH出血量评分;通过测定脑组织EB含量评价不同组小鼠血脑屏障通透性;免疫荧光染色观察小鼠SAH后脑组织中NETs和微血栓的生成情况;采用干湿重法检测脑组织含水量;Western blot检测CitH3及血脑屏障相关蛋白的表达;通过FJC及TUNEL染色观察小鼠SAH后神经元细胞的损伤和凋亡凋况。第三部分,采用颈内动脉血管内穿刺法建立小鼠SAH模型,研究分为3组:假手术组(Sham 组),溶剂组(SAH+Vehicle 组),DNase Ⅰ 干预组(SAH+DNase Ⅰ 组)。SAH+DNase Ⅰ组在造模成功后1小时后给于腹腔及静脉注射DNase Ⅰ,SAH+Vehicle组注射相应体积的生理盐水。蛛网膜下腔出血模型建立后6小时,采用激光散斑血液监测仪监测小鼠大脑皮质血流量。结果:1.Anti-Ly6G抗体通过清除中性粒细胞抑制NETs生成在小鼠SAH后早期脑损伤中发挥保护作用1.1.Anti-Ly6G抗体能够显著减少SAH后小鼠外周血中中性粒细胞数量。1.2.通过改良Gacia神经功能评分、平衡木实验评分发现,anti-Ly6g抗体干预可以显著改善SAH后小鼠的神经功能障碍。1.3.EB含量测定、Western blotting检测表明anti-Ly6G抗体干预可减轻SAH导致的EB染料经渗出、增加脑组织中Occludin、ZO-1的表达,提示anti-Ly6G抗体干预可以减轻小鼠SAH后脑组织血脑屏障的破坏。1.4.Anti-Ly6G抗体干预能够显著减轻SAH后小鼠的脑含水量,减少脑组织神经元细胞损伤和凋亡数量。1.5.Anti-Ly6G抗体干预能够显著减少S AH后小鼠大脑皮层NETs及微血栓的生成。2.DNase Ⅰ通过清除NETs抑制微血栓形成,在小鼠SAH后早期脑损伤中发挥保护作用2.1.通过改良Gacia神经功能评分、平衡木实验评分发现,DNase Ⅰ干预可以显著改善小鼠SAH后的神经功能障碍。2.2.EB含量测定、Western blotting检测表明DNase Ⅰ干预可减轻SAH导致的EB染料渗出、增加脑组织中Occludin、ZO-1的表达,提示DNase Ⅰ干预可以减轻小鼠SAH后脑组织血脑屏障的破坏。2.3.DNase Ⅰ干预能够减轻SAH后小鼠的脑含水量、减少神经元细胞损伤和凋亡数量。2.4.DNase Ⅰ干预能够显著减少SAH后小鼠大脑皮层的NETs和微血栓的生成。2.5 DNase Ⅰ干预能够显著减轻小鼠SAH后早期大脑皮层低灌注。结论:SAH后小鼠大脑皮层NETs的生成和微血栓形成密切相关,利用anti-Ly6G抗体和DNase Ⅰ干预减少NETs生成可以抑制微血栓的形成,从而减轻小鼠SAH后早期大脑皮层低灌注、脑含水量、血脑屏障的破坏,减少神经元细胞的损伤和凋亡数量,改善了小鼠神经功能障碍,从而在SAH后的早期脑损伤中发挥神经保护作用。第三部分:NETs在小鼠SAH后脑脊液循环障碍和继发性脑积水中的作用研究目的:观察DNase I干预对小鼠SAH后脑脊液循环障碍及继发性脑积水的影响,进一步探讨NETs在SAH后脑损伤中的作用和机制。方法:本genetic fate mapping研究共分为二个部分。第一部分,采用颈内动脉血管内穿刺法建立小鼠SAH模型。研究分为3组:假手术组(Sham 组),溶剂组(SAH+Vehicle 组),DNase I 干预组(SAH+DNase I 组)。SAH+DNase I组在造模成功后1小时后给小鼠腹腔及静脉注射DNase I,SAH+Vehicle组注射相应体积的生理盐水。在脑出血模型建立24小时后经枕大池注射EB溶液,待其循环1小时后处死小鼠,观察颅底EB染料的分布情况,并检测前脑及颈深淋巴结组织中EB浓度。第二部分,建立小鼠SAH模型(方法及分组同上)。分别在SAH模型建立后第1天、第3天使用7.0T小动物磁共振扫描仪对小鼠进行头颅扫描,测算脑室体积,以评估不同组小鼠脑室扩张程度。结果:1.在SAH后24小时,通过观察颅底EB染料的分布情况、检测前脑及颈深淋巴结组织中EB染料浓度发现,SAH+Vehicle组小鼠脑积液循环明显受阻;而DNase I干预能够促进EB染料在SAH+DNase I组小鼠颅底的分布,提高前脑及颈深淋巴结组织中EB染料浓度,提示DNase I干预减轻了小鼠蛛网膜下腔后脑积液循环障碍及颈深淋巴引流障碍。2.通过分析脑组织磁共振成像图片发现,小鼠SAH后第一天、第三天脑室扩张明显,而DNase I干预能够明显减轻相应时间点脑室扩张程度,提示DNase I干预能够减轻小鼠SAH后脑积水。结论:DNase I清除NETs可以有效减轻小鼠SAH后脑脊液循环障碍及淋巴引流受损,减轻脑室扩张程度。这提示NETs可能在小鼠SAH后脑积液循环障碍、淋巴引流受损以及脑积水形成中发挥着重要作用。