在开花植物中,雄性发育过程需要转录层面的精确调控。尽管已有多个转录因子(TF)被报道在花粉育性中发挥作用,但绒毡层发育和花粉壁toxicogenomics (TGx)形成的主要转录调控网络仍然存在许多未知。因此挖掘潜在的雄性发育转录调控相关基因,对于进一步了解花粉发育过程十分必要。在本研究中,我们鉴定了一份因绒毡层发育和花粉壁形成障碍导致雄性不育的水稻突变体aberrant microspore development1(amd1)。AMD1编码一个未知蛋白,该类蛋白在植物中的功能尚无报道,我们对其展开了系统的功能探索。本研究发现AMD1可与绒毡层发育关键转录因子TAPETUM DEGENERATION RETARDATION(TDR)互作,并Liraglutide纯度且能够结合两个花粉外壁发育基因DPW和OsPKS2的启动子并激活其表达,提示AMD1可能通过与TDR互作以及作为DPW和OsPKS2的上游转录调节蛋白参与水稻雄性发育。主要研究结果如下:1.通过甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变籼稻品种9311,获得了一份雄性不育突变体amd1。与野生型相比,amd1突变体在营养生长期并无明显差异,但其抽穗期的花药比野生型略小,呈淡黄色。荧光素二乙酸(fluorescein diacetate,FDA)染液和碘-碘化钾(iodine-potassium iodide,I_2-KI)花粉染色结果表明amd1的花粉粒无活性。进一步通过半薄切片、透射电镜及扫描电镜观察结果显示,amd1在绒毡层,花粉壁及小孢子的发育中存在缺陷,说明AMD1的功能障碍不仅影响绒毡层细胞的程序性死亡(programmed cell death,PCD),还影响花粉外壁的形成和小孢子的发育。2.通过MutMap分析,我们在1号染色体上,发现了一个单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)指数最高的点突变。该突变位于LOC＿Os01g55094的第三个外显子,并诱导了终止密码子产生,导致蛋白翻译提前终止。连锁分析表明该突变与雄性不育表型共分离。进一步利用CRISPR/Cas9技术,在ZH11背景下获得两个AMD1基因的敲除突变株系cr-1和cr-2。这两个敲除突变植株的表型与amd1突变体相似,selleck HPLC都产生了不育的花粉。这些结果表明LOC＿Os01g55094就是AMD1基因。3.qPCR分析表明AMD1在水稻5-6 mm的小花中表达量最高,进一步β-glucuronidase(GUS)染色和RNA原位杂交切片观察显示,AMD1主要在减数分裂时期的绒毡层和小孢子中表达,在花粉壁形成时期只在绒毡层中特异表达,这些结果支持AMD1在花粉和绒毡层发育中发挥一定的功能。亚细胞定位显示AMD1蛋白定位于细胞核上,且该定位方式依赖于其蛋白序列上的两个核定位信号。通过酵母双杂(Yeast two hybrid,Y2H)及双荧光素酶(Dual-luciferase,D-LUC)报告系统表明AMD1蛋白具有转录激活活性。4.转录组分析发现角质、蜡质和脂肪酸代谢通路中的有关基因在突变体小花中下调表达。应用qPCR对突变体中部分下调表达的基因进行了验证,结果与转录组所示结果一致。在下调的基因中,我们运用酵母单杂(Yeast one hybrid,Y1H)及D-LUC报告系统筛选出了AMD1可能直接调控的下游靶标DPW和OsPKS2。由于这两个基因主要参与花粉外壁形成所需的孢粉素代谢,我们因此推测AMD1可能通过直接调控它们的表达来影响水稻花粉外壁的发育。5.由于amd1的绒毡层PCD略有延迟,且AMD1具有转录激活活性并主要在绒毡层中表达,我们推测AMD1可能也参与到了水稻绒毡层内的转录调控网络中。我们利用Y2H系统以AMD1为诱饵对水稻穗部组织酵母文库进行筛选。通过Y2H筛选,我们发现AMD1能够与调控绒毡层关键转录调节因子TDR互作。我们进一步应用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)、荧光素酶互补图像检测(Luciferase complementation imaging,LCI)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)系统证实AMD1与TDR在植物细胞中的相互作用。此外,差异表达基因分析结果暗示AMD1与TDR之间可能具有共同作用的靶标。上述结果说明AMD1可能是通过与TDR互作来参与水稻绒毡层的发育。综上,我们推测AMD1是水稻雄性育性转录调控网络中的一个新组分,参与绒毡层降解和花粉外壁形成。本研究为水稻有性繁殖的调控网络提供了新的见解,并为水稻杂交育种提供了一个有用的遗传资源。