目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructive sleep apneahypopnea syndrome,OSAHS)是心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的独立风险因素,其主要病理特征是慢性间歇性缺氧(Chronic intermittent hypoxia,CIH)。已有研究表明缺氧、缺血等因素会造成血管内皮损伤。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)是干细胞的一种,能够发挥血管损伤修复、新血管生成等功能。新近研究表明,富氢生理盐水(Hydrogen-rich saline,HRS)能改善内皮细胞功能,有助于抗氧化应激及治疗缺血再灌注损伤。既往研究表明,Sirtuin 3(SIRT3)的表达上调可通过抑制线粒体氧化损伤改善EPCs的再内皮化能力,从而改善高血压患者的心血管损伤,而HRS是否对CIH诱导的EPCs损伤具有保护作用,尚未见相关研究报道。基于此,本研究通过模拟OSAHS构建CIH下体外培养EPCs模型,研究HRS通过SIRT3/complex I/ATP通路对CIH诱导的EPCs功能的影响。方法:1.采用人外周血EPCs作为体外细胞实验的模型。常规培养作为空白对照组(Control组),对EPCs进行不同CIH循环干预,模拟OSAHS患者建立CIH的细胞模型作为缺氧对照组(CIH组),建立EPCs单纯HRS干预作为阳性对照组(HRS组),CIH与HRS共同干预的细胞作为治疗组(CIH+HRS组),转染SIRT3 si RNA入EPCs,构建SIRT3敲低的EPCs模型,并进行CIH和HRS干预作为敲低SIRT3的治疗模型组(CIH+HRS+si-SIRT3组)。2.实时荧光定量聚合酶链反应(Real time quantitative reverse transcription-PCR,q RT-PCR)检测不同干预条件下各组EPCs中Sirtuin家族的m RNA水平。3.蛋白免疫印迹实验(Western blot,WB)检测不同干预条件下各组EPCs中SIRT3的蛋白水平。4.CCK-8实验方法检测0、5、10、12、15个CIH循环下EPCs的OD值,绘制细胞生长曲线,比较不同循环次数下各组的细胞增殖活性。5.集落增殖实验评价不同干预条件下各组细胞的增殖能力。6.划痕愈合实验评价不同干预条件下各组细胞的划痕愈合能力。7.Transwell小室实验检测不同干预条件下各组细胞的迁移能力。8.Matrigel基质胶方法检测不同干预条件下各组细胞的管形成能力。9.线粒体呼吸链复合体I/III(Mitochondrial respiratory chain complex I/III,Complex I/III)活性检测试剂盒(微孔法)评价不同干预条件下各组细胞的Complex I/III活性。10.线粒体膜电位surface immunogenic protein检测试剂盒(JC-1)和ATP含量试剂盒分别评价不同干预条件下各组细胞的线粒体膜电位水平和ATP含量。结果:1.CCK-8实验检测结果:对EPCs进行不同CIH循环数干预后,12个CIH循环下EPCs的活性较Control组明显降低(P=0.003),以此确定EPCs的CIH干预模型。2.q RT-PCR检测结果:CIH组SIRT3的m RNA表达水平较Control组明显降低(P=0.025),CIH+HRS组SIRT3的m RNA表达水平较CIH组明显升高(P=0.037)。3.Western blot检测结果:CIH组SIRT3的蛋白表达水平较Control组明显下降(P=0.027),CIH+HRS组SIRT3的蛋白表达水平较CIH组明显升高(P=0.039),CIH+HRS+si-SIRT3组SIRT3的蛋白表达水平较CIH+HRS组明显下降(P<0.0001)。4.集落增殖实验检测结果:CIH组的细胞增殖数较Control组明显减少(P=0.039),CIH+HRS组的细胞增殖数较CIH组明显增多(P=0.001),CIH+HRS+si-SIRT3组的细胞增殖数较CIH+HRS组明显减少(P=0.001)。5.划痕愈合实验检测结果:CIH组的划痕愈合率较Control组明显下降(P=0.005;P=0.014),CIH+HRS组的划痕愈合率较CIH组明显升高(P<0.0001;P=0.003),CIH+HRS+si-SIRT3组的划痕愈合率较CIH+HRS组明显下降(P<0.0001;P<0.0001)。6.Transwell迁移实验结果:CIH组的迁移细胞数较Control组明显减少(P=0.002),CIH+HRS组的迁移细胞数较CIH组明显增多(P=0.003),CIH+HRS+si-SIRT3组的迁移细胞数较CIH+HRS组明显减少(P<0.0001)。7.Matrigel基质胶管形成实验结果:CIH组管形成率较Control组明显下降(P=0.007),CIH+HRS组管形成率较CIH组明显升高(P=0.014),CIH+HRS+si-SIRT3组管形成率较CIH+HRS组明显下降(P=0.042)。8.Complex I和III活性检测结果:CIH组Complex I和III活性较Control组明显下降(P=0.005;P=0.002),CIH+HRS组线Complex I和III活性较CIH组明显升高(P=0.003;P=0.038),CIH+HRS+si-SIRT3组Complex I和III活性较CIH+HRS组明显下降(P=0.017;P<0.0001)。9.线粒体膜电位和ATP含量实验检测结果PF-02341066 IC50:CIH组线粒体膜电位和ATP含量较Control组明显下降(P=0.002;P=0.https://www.selleck.cn/products/cobimetinib-gdc-0973-rg7420.html011),CIH+HRS组线粒体膜电位和ATP含量较CIH组明显升高(P=0.007;P=0.043),CIH+HRS+si-SIRT3组线粒体膜电位和ATP含量较CIH+HRS组明显下降(P=0.047;P=0.033)。结论:1.HRS干预改善了CIH诱导的EPCs增殖、迁移和管形成功能损伤以及线粒体功能下降。2.HRS干预逆转了CIH诱导的EPCs中SIRT3的表达下降。3.使用si RNA抑制SIRT3表达后,HRS对CIH诱导的EPCs损伤的改善作用消失,同时还抑制了下游complex I的活性和ATP的含量,提示HRS改善CIH诱导的EPCs损伤可能是由SIRT3/complex I/ATP通路介导的,为HRS应用于临床OSAHS患者的治疗提供有力的基础研究证据。