猕猴桃作为重要的经济作物,其富含的营养价值以及良好的口感深受人们的喜爱,因此其市场需求和种植规模也日益扩大。然而猕猴桃育种前期需要长达3-4年的时间才能开花,当春芽进入休眠状态后会发育成有花序的芽。SOC1(OF OVEREXPRESSIONSHORSUPPRESSOR OF CONSTANS 1)和SVP(T VEGETATIVE PHASE)对猕猴桃芽CHIR-99021的萌发in vivo infection与休眠有调节作用,并且在调节植物开花过程中发挥着重要功能,尽管它们在春化途径和环境温度途径中取得了诸多进展,但在猕猴桃中如何响应环境温度从而调节花期的研究鲜见报道。探究SOC1和SVP在猕猴桃中的功能,有助于更好的解析猕猴桃花期调控网络,为猕猴桃提前开花提供解决思路。本课题选用红阳猕猴桃作为实验材料,通过生物信息学分析、基因克隆、基因编辑及实时荧光定量PCR等方法探究了AcrSOC1c和AcrSVP1基因在猕猴桃中的表达特性及转录对温度的响应变化。首先对SOC1和SVP基因进行序列比对,在猕猴桃中共鉴定出8个AcrSOC1s和6个AcrSVPs同源基因。系统发育树的结果显示猕猴桃AcrSVP1与At SVP和Ac SVP2的同源性高达86%以上,AcrSOC1c与At SOC1、Ac SOC1e和Ac SOC1i的同源性高达92%以上。随后,对AcrSOC1s和AcrSVPs进行了氨基酸序列比对,结果显示所有的AcrSOC1s和AcrSVPs蛋白都包含MADS-box家族典型且保守的MADS-box和K-box结构域,说明它们的蛋白质功能结构域保守。启动子序列的分析结果表明,AcrSOC1s和AcrSVPs除了经典的顺式元件还含有多种与非生物胁迫响应相关的顺式元件,如AcrSVP1含有LTR低温响应元件,AcrSOC1c含有GARE-motif赤霉素响应元件等。RT-q PCR结果显示,绝大多数AcrSOC1s和AcrSVPs在红阳猕猴桃花苞中呈现出高表达,但在花中表达量较低。其次,分别克隆了AcrSOC1c和AcrSVP1基因的SRF结构域、K-box结构域和启动子区域的DZ-IETD-FMKNA序列。随后,根据测序结果对上述序列进行靶位点预测,共设计了120个sg RNA种子序列,之后将这些引物混合互补配对后直接连接PTG-Cas9-TV载体,成功构建了sg RNA混合载体文库。借助混合的sg RNA对猕猴桃目标序列进行多位点编辑,可以高效的确保了目标基因发生突变,最终获得了AcrSOC1c和AcrSVP1启动子区域被编辑的多个突变体,包括soc1c-6、soc1c-7以及svp1-4。结合RT-q PCR分析,结果显示这几个突变体中目标基因的转录水平较野生型或未发生编辑的植株而言都发生了不同程度的变化,并且转录水平会随不同的温度处理以及处理时长表现出差异。综上所述,本研究通过生信分析鉴定出猕猴桃的AcrSOC1s和AcrSVPs,并通过转化sg RNA混合产物的方式成功编辑了AcrSOC1c和AcrSVP1的启动子区域,使得基因的转录水平在不同温度的处理下表现出与野生型不同的变化。结合AcrSOC1c和AcrSVP1对其他植物开花的影响,本课题的研究结果不仅成功验证了sg RNA混合产物对猕猴桃基因组编辑的可行性,拓展了猕猴桃的基因组编辑技术,所获得的突变体植株也为后期探究环境温度对猕猴桃花期的调控奠定了基础。猕猴桃花期的精准调控使得对猕猴桃花期关键调控元件的进一步研究具有重要的科研意义和商业价值。