研究背景:胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是最常见的富有侵袭性的胰腺恶性肿瘤,占胰腺癌病例的90%以上,俗称“癌中之王”,死亡率极高,其5年生存率仅11%左右。PDAC的主要治疗手段包括手术切除、辅助化疗(adjuvant chemotherapy,ACT)和免疫治疗。但是,大部分PDAC患者对此类治疗的总体响应率仍然很低。因此,深入探究PDAC的肿瘤生物学机制,开发潜在的有效诊断和治疗方案仍是根治PDAC的重要任务。蛋白质的异常糖基化涉及PDAC的多种病理和病理生理变化,包括但不限于赋予肿瘤抵抗细胞死亡的能力。糖基化是一种广泛存在的蛋白翻译后修饰方式(posttranslational modification,PTM),在稳定蛋白质结构、引导蛋白质正确定位、辅助分子伴侣二聚化等方面发挥重要作用。最新的研究表明,蛋白质的异常糖基化可病理性重塑肿瘤分子生物学进程,增强肿瘤细胞对死亡信号的抵抗。铁死亡是一种新型的非调节性细胞死亡形式,其特征是铁离子依赖的膜脂质过氧化物毒性堆积导致细胞膜破裂,是治疗恶性肿瘤的新的有效手段。在铁死亡的抗氧化系统中,谷氨酸/胱氨酸逆向转运体system Xc-的研究最为广泛,其由重链亚基4F2hc(也称为CD98hcAdavosertib作用,由SLC3A2基因编码)和轻链亚基xCT(由SLC7A11基因编码)组装而成,负责介导胞内半胱氨酸合成和抗氧化系统的建立。目前围绕xCT的研究较为广泛,但忽视了 4F2hc是xCT细胞膜定位和功能发挥的重要前提条件之一。糖基化和铁死亡是肿瘤代谢异常的重要生物学现象,可为癌症治疗提供新的干预措施。然而,目前尚不明确糖基化和铁死亡二者之间的相互关系,以及是否靶向糖基化途径可增强PDAC对铁死亡的敏感。研究方法:1.利用N-和O-糖基化蛋白质组学,揭示PDAC细胞铁死亡过程中糖基化修饰的改变和具体修饰类型,明确PDAC细胞铁死亡中糖蛋白和糖肽的差异表达变化,鉴定与铁死亡调节相关的重要糖蛋白。2.采用N-糖苷酶(PNGase F)(一种重组糖苷酶主要用于移出多肽链上天冬酰胺连接的寡糖)或使用蛋白N-糖基化抑制剂衣霉素(tunicamycin,TM),明确目标糖蛋白的主要修饰类型。3.利用RNA-seq技术,探究PDAC细胞铁死亡中糖基化转移酶的表达变化,明确与铁死亡调节相关的糖基化转移酶,鉴定潜在的与目标糖蛋白修饰相关的差异表达糖基化转移酶。4.利用291例PDAC患者的组织样本及对应的临床病理及预后信息,探究糖蛋白4F2hc和糖基化转移酶B3GNT3在PDAC组织中的表达及临床预后意义。5.采用慢病毒介导的基因稳定敲降技术,探究4F2hc在PDAC细胞铁死亡中的具体作用,明确4F2hc的N-糖基化修饰对PDAC细胞铁死亡的影响。6.采用慢病毒包装的CRISPR-cas9介导的基因敲除技术,探究B3GNT3在PDAC细胞铁死亡中的具体作用,明确B3GNT3的糖基化转移酶活性对PDAC细胞铁死亡的影响。7.采用氨基酸位点突变、片段截短、分子动力学模拟、DynaMut、PredyFlexy、免疫荧光、流式分析、放线菌酮追踪等方法,探究N-糖基化修饰和B3GNT3的糖基转移酶活性对4F2hc蛋白稳定性的影响,探究抑制4F2hc的N-糖基化对其分子伴侣xCT的细胞膜定位、表达及功能发挥的影响。8.通过建立裸鼠PDAC皮下及原位移植瘤模型,探究4F2hc和B3GNT3对PDAC体内增殖活性的影响,联合铁死亡诱导剂IKE或蛋白N-糖基化抑制剂衣霉素探究对SLC3A2敲降介导的PDAC体内抑制效果。研究结果:1.N-糖基化修饰在PDAC铁死亡中应激性上调,差异糖蛋白4F2hc的天冬酰胺(N)-糖基化修饰参与PDAC细胞铁死亡。2.N-糖基化修饰是内源性4F2hPrimers and Probesc蛋白的主要转录后翻译修饰方式,糖基化转移酶B3GNT3是4F2hc的重要结合蛋白,参与4F2hc的N-糖基化修饰。3.4F2hc和B3GNT3在PDAC细胞和临床肿瘤组织中高表达,4F2hc和B3GNT3的高表达与PDAC患者的进展和较差的临床预后正相关。4.机制上,基因敲降SLC3A2或阻断4F2hc的N-糖基化可导致system Xc-活性受损(表现为脂质过氧化物的增加),促进PDAC细胞对铁死亡敏感。在shSLC3A2 PANC-1和MIAPaCa-2细胞中,重组野生型的4F2hc增强PDAC细胞对铁死亡抗性。而重组4F2hc的N-糖基化位点突变体N365Q和4NQ不能逆转RSL3诱导的细胞活力下降,反而增强shSLC3A2 PANC-1和MIAPaCa-2细胞对RSL3诱导的铁死亡敏感。5.基因敲低或敲除B3GNT3促进PDAC细胞对铁死亡的敏感。重组B3GNT3糖基化转移酶酶活性过表达质粒122-311OE部分恢复RSL3导致的B3GNT3KO PANC-1和MIAPaCa-2的细胞活力下降,而重组B3GNT3糖基化转移酶缺失片段122-311del则无法逆转。6.敲除B3GNT3加速4F2hc的蛋白衰减,降低4F2hc的细胞膜定位及4F2hc与xCT的相互作用;无论是突变4F2hc的N-糖基化修饰位点,还是使用衣霉素去除4F2hc的N-糖原结构,皆明显降低4F2hc蛋白的吉布斯自由能(ΔΔG),导致4F2hc蛋白稳定性下降,细胞膜定位减少,削弱4F2hc与xCT的相互作用。7.蛋白N-糖基化抑制剂TM显著增强铁死亡诱导剂IKE和CSF-1R抑制剂RSL3诱导的PDAC细胞脂质过氧化和铁死亡的发生。8.在体内研究中,敲除B3GNT3显著抑制PANC-1细胞的皮下和原位移植瘤生长。基因敲减SLC3A2或联合铁死亡诱导剂IKE或TM显著抑制原位PDAC的生长。研究结论:1.N-糖基化修饰参与PDAC铁死亡进程。2.糖基化转移酶B3GNT3介导的4F2hc的N-糖基化修饰影响PDAC细胞对铁死亡的敏感性。3.靶向干预B3GNT3-4F2hc-N-糖基化修饰途径,可导致4F2hc蛋白稳定性下降,细胞膜定位减少,破坏4F2hc与xCT的相互作用,促进PDAC细胞对铁死亡敏感。4.4F2hc和B3GNT3在PDAC中高表达预示患者临床预后较差,靶向抑制二者的表达可有效降低PDAC在体外和体内的细胞生物学活性。研究意义1.有望从糖基化修饰的新角度,揭示铁死亡在肿瘤研究中的新机制。2.整合N-/O-糖基化蛋白质组学和转录组学,有望解析肿瘤细胞铁死亡过程中糖基化修饰图谱的变化。3.通过筛选并鉴定铁死亡调节通路中的差异糖蛋白和糖基化修饰位点,为铁死亡的响应提供潜在的生物标志物,为基于铁死亡策略治疗恶性肿瘤提供新的干预靶点。4.为临床前研究联合糖基化抑制剂和铁死亡诱导剂对恶性肿瘤的治疗提供实验基础。5.基于本课题新发现的B3GNT3-4F2hc-N-糖基化修饰轴在PDAC铁死亡中的调节作用,为拓展和开发新的肿瘤干预靶点和治疗策略提供重要研究思路。