泛素化修饰是常见的蛋白质翻译后修饰类型,是单泛素或泛素链分子在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的连续催化下连接到靶蛋白上的过程。而去泛素化则是由去泛素化酶(DUB)催化将这些修饰分子从靶蛋白上水解掉的逆反应过程。泛素是由76个氨基酸组成的分子量为8.5 k Da的小蛋白质,其7个赖氨酸位点与N端的甲硫氨酸位点均可被泛素化修饰,进而形成不同类型的泛素链分子。一个泛素分子N端甲硫氨酸的α氨基与另一个泛素分子C端第76位甘氨酸的α羧基连接形成的是线性泛素链,也称为M1型泛素链。本实验室前期的研究发现线性泛素链对靶蛋白具有整链修饰的功能,为揭示参与此修饰过程的相关酶,也为阐明相关修饰机制的研究提供实用的研究工具,本研究应用本实验室发明的新策略,制备了线性泛素链蛋白与探针,并应用细胞内外反应进行了功能分析与实用性验证。首先,本研究在大肠杆菌中成功表达纯化了所构建的线性泛素链探针蛋白,然MDV3100供应商后利用Intein化学合成技术,成功制备出线性泛素链探针。所制备的探针使用Strep Tag II作为报告标签,用于分离和提取被探针捕获的酶;识别元件使用75位突变型(G75A)、76位突变型(G76A)和野生型(WT)三种类型线性泛素链,用于介导探针与酶的非共价互作;反应基团(也称靶向弹头)使用的是溴乙胺(Br2)和炔丙胺(Prg),用于探针与酶活性中心的半胱氨酸形成共价键,从而实现相关酶的捕获与分离。同时,本研究还在HEK293T、Hep G2和Hela细胞内外分析了这些线性泛素链蛋白的修饰功能与稳定性,并应用这些细胞的裂解物验证了所制备的重组线性泛素链探针捕获分离泛素化相关酶的实用性。结果表明,所制备的三种类型的线性泛素链均可在细胞内发挥修饰功能,相比WT型链,G75A型链最不稳定,而G76A型链最稳定,可以修饰更多的靶向蛋白,此结果说明G75A突变破坏了泛素链的稳定性,而G76A突变则增强了泛素链的稳定性,此结果还暗示,这些泛素化修饰反应过程可能还同时伴随着去泛素化的反应过程。细胞外的互作结果显示,WT型链探针不与去泛素化酶OTULIN结合,但可被OTULIN水解,说明所制备的WT型泛素链为天然连接,在含有特异水解酶条件下不稳定;G75A型链探针不与OTULIN结合,更易被水解;G76A型链探针不被OTULIN水解,但也不与OTULIN结合,结合细胞内结果,进一步证明G75A突变影响了泛素链的稳定性,而G76A突变则增强了泛素链的稳定性,同时说明OTULIN属于内切酶类,泛素分子的G75和G76两保守位点对单泛素分子和泛素链的稳定性以及OTULIN的水解活性至关重要。功能性研究发现,三种类型的线性泛素链探针均可靶向捕获去泛素化酶UCH-L3形成共价加合物(adduct),但不与去泛素化酶USP15互作,证明本研究制备的探针具有靶向特异性。应用HEK293T、Hela和Hep G2三种细胞系进行PR-171探针捕获酶的研究,结果发现,双泛素及四泛素长度的WT型线性泛素链探针均可从三种细胞裂解物中捕获包括E1、E2、E3和DUB四种酶在内的各种细胞内蛋白,但未发现两种突变型链探针与酶形成的加合物,说明Ubiquitin-mediated proteolysis天然反应条件下,泛素C末端的两个非手性Gly位点的突变可能影响了线性泛素链的空间结构及其非手性构象变化的灵活性,进而破坏了探针与靶酶的识别与互作。本研究还利用LC-MS/MS对WT型链探针所捕获的蛋白进行鉴定,结果显示,四泛素探针成功捕获了泛素E1激活酶(UBE1)、泛素E2结合酶(UBE2O、UBE2NL)、泛素E3连接酶(HUWE1、PRKN)以及去泛素化酶(UCH-L5)等蛋白。而除上述酶外,WT型双泛素探针还捕获了E1激活酶(UBA6)、E2结合酶(UBE2S、UBE2K,UBE2A、UBE2T)、E3连接酶(TRIM4、RNF40、MNAB、UBE3A)以及去泛素化酶(OTUB1、USP5、USP14、USP24、USP9X)等蛋白。除了这些与泛素化反应相关的酶外,这两种长度的WT型链探针还捕获了其他类型的蛋白。此结果说明,本研究所制备的WT型探针具有捕获分离泛素化相关酶的实用价值。总之,本研究制备的重组线性泛素链蛋白和探针在细胞内外均具有功能性,重组链蛋白具有细胞内修饰功能,探针可有效捕捉分离泛素化反应相关的酶,因此,这些成果将为线性泛素化研究领域提供重要的研究材料和技术支持。