牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水经济鱼类,在其生长过程中,雌性比雄性个体大且生长快,因此对其性别分化与性腺发育的研究十分重要。foxl3作(Forkhead box L3)为foxl2(Forkhead box L2)的旁系同源基因,被认为是鱼类所特有的副本基因,且在性腺中高表达,在多种鱼类的发育、胚胎发育、代谢等过程中发挥重要的作用。foxl3在不同鱼类中的表达情况和发挥的功能可能并不完全一致,因此其在牙鲆性腺发育的功能有待研究。本研究通过PCR克隆和测序验证了foxl3 c DNA的正确性,并利用各种生物信息学手段对foxl3分子特征进行了分析。采用实时荧光定量PCR技术检测foxl3在牙鲆不同组织中的表达情况,并利用亚细胞定位技术和化学原位杂交技术观察了foxl3的表达定位。之后,分别将foxl3干扰连和foxl3过表达质粒分别转染至牙鲆性腺原代细胞中,通过定量PCR检测了foxl3、fbxo47(减数分裂重组蛋白a)和sycp3(F-box蛋白47)的表达变化。并且通过靶基因预测网址筛选出与foxl3具有靶向关系的miRNAs(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429),利用绿色荧光蛋白以及双荧光素酶技术对其进行靶向关系验证,并将预测得到的结合位点进行定点突变后进一步对其进行靶向关系的验证。本研究主要结果为:1、牙鲆foxl3基因的鉴定及分子特征通过PCR克隆和测序得到牙鲆foxl3的c DNA序列,共1089 bp,包括750 bp的CDS区和289 bp的3’UTR区。共编码429个氨基酸,其中脯氨酸的含量最高;蛋白质质量为28.70 kDa,理论等电点、亲水系数和理论等电点分别为8.77、-0.842和63.85。牙鲆Foxl3二级结构包含一个FH结构域;三级结构则为20.48%α螺旋、15.26%延伸链以及64.26%无规则卷曲,不均匀分布在蛋白多肽链上。比较多种生物Foxl3氨基酸序列发现,牙鲆Foxl3与其他鱼类相似度较高,其中与大菱鲆(Scophthalmus maximus)同源性最高,达到91.97%,与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最低,仅为66.27%。通过氨基酸序列比对发现,与Foxl2相比,Foxl3在不同物种之间的差异更为显著,说明foxl3的进化速度比foxl2快。系统进化树分析发现牙鲆Foxl3首先与大菱鲆聚为一类,再与大黄鱼(Larimichthys crocea)、尼罗罗非鱼(OreochromiMesoporous nanobioglasss niloticus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、青鳉(Oryzias latipes)和斑马鱼这些硬骨鱼类聚集。而牙鲆的Foxl2也是首先与大菱鲆聚为一支,再与青鳉、尼罗罗非鱼、黄鳝(Monopterusalbus)、半滑舌鳎和斑马鱼聚为一支,二者分属不同的分支。2、foxl3在牙鲆雌雄https://www.selleck.cn/products/byl719.html性腺中的表达及功能分析实时荧光定量PCR结果显示:foxl3在牙鲆精巢、卵巢、肠、肌肉、鳃、胃、脑、肝和心脏中均有表达,但在卵巢中表达最高,显著高于其他组织;亚细胞定位结果表明,Foxl3融合蛋白在细胞核和细胞质中均有表达;化学原位杂交结果显示foxl3在牙鲆精卵巢中均有表达,在卵巢中,阳性信号主要在Ⅱ-Ⅳ期卵母细胞中表达,同样在间质细胞中也检测到其表达。在精巢中,foxl3则在精原细胞和精子中表达,此外在间质细胞中也有少量阳性信号被检测到。fbxo47和sycp3这两个与减数分裂相关的基因在性腺发育中具有重要的作用。为进一步探究foxl3在牙鲆性腺中的作用,通过荧光定量检测其与fbxo47和sycp3共表达情况,并通过RNAi和过表达实验分析了foxl3对二者基因表达的影响,结果显示:与foxl3在牙鲆卵巢中的高表达相反,fbxo47和sycp3则在精巢中的表达量高于卵巢。牙鲆精巢和卵巢原代细胞经siRNA干扰36 h后,foxl3的表达量显著降低,与减数分裂相关的基因fbxo47和sycp3在精卵巢中的表达量均显著被抑制。当过表达foxl3后,精卵巢中的fbxo47和sycp3的表达量显著增加,表明foxl3基因可能直接或间接调控fbxo47和sycp3基因的表达,进而对牙鲆的性腺发育产生影响。3、miR-200家族与foxl3作用关系的预测与鉴定为了证实foxl3与miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-141和miR-429)之间的作用关系,构建了双荧光素酶报告系统质粒和绿色荧光报告质粒。双荧光素酶报告实验结果表明:和NC组相比,foxl3野生型重组质粒与miR-200a mimics共转染组的荧光活性显著降低,而与miR-200b mimics、miR-141 mimics和miR-429mimics共转染组则无显著变化。定点突变后,foxl3突变型重组质粒和miR-200a mimics共转染组的荧光活性则无显著PF-07321332差异。绿色荧光蛋白实验也得到了同样的结果,证明foxl3与miR-200a存在靶向关系,miR-200a可以负向调控foxl3,即foxl3是miR-200a的靶基因。综上所述,miR-200a可能通过靶向调控foxl3的表达,进而影响fbxo47和sycp3的表达,从而调节牙鲆性腺的功能。