胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一种强侵袭性恶性脑肿瘤,患者中位生存期12-15个月,常规的治疗方法是手术切除,结合放疗和替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)辅助化疗。TMZ的内在性耐药和获得性耐药是GBM治疗的主要障碍,已探明机制包括血脑屏障以对抗肿瘤靶向药物的作用,但是其耐药机制仍然不是十分清楚。多项研究显示O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(O6-methylguanine methyltransferase,MGMT)对TMZ诱发的肿瘤基因损伤能够直接修复,这是TMZ耐药的一个重要原因,但最近发现TMZ耐药的部分GBM患者表现出MGMT活性缺失。因此,迫切需要明确不依赖于MGMT的TMZ耐药机制,并制定出针对GBM患者的替代化疗策略。本研究基于CPTAC数据库筛选出在Empagliflozin溶解度胶质瘤中改变频率较高的CtIP和PAXX基因;通过CGGA数据库分析了其表达水平与患者生存及预后的相关性,结果显示低m RNA水平以及高甲基化水平有利于患者存活和预后,即抑制RBBP8和PAXX基因有利于患者存活;使用斯皮尔曼系数计算相关性、筛3-MA NMR选共表达基因,并利用KEGG(京都基因与基因组百科全书)分析富集信号通路,发现主要富集到代谢、细胞凋亡、DNA损伤修复通路,为后续通过实验阐明CtIP和PAXX基因在胶质瘤治疗中的潜在价值奠定基础。同时,我们对于TMZ以及其在人体中的活性药物MTIC进行了量子化学计算,从HOMO-LUMO(最高占据轨道与最低空轨道)、ELF(电子定域化函数)、ALIE(平均局部电离能)多个方面描述其化学性质,并基于靶点预测和分子对接对其潜在的药物功能进行挖掘,发现其可能有抑制HR修复,JNK通路,NFκB通路的潜力,有助于更深入地认识这一药物,为后续新型抗胶质瘤药物的开发提供线索。前期已发表的研究表明,DNA损伤修复是一种促成TMZ耐药的重要BIOPEP-UWM database机制,结合生物息学分析,我们认为DNA损伤修复的关键因子CtIP和PAXX可能是改善TMZ耐药GBM化疗的潜在靶点。临床TMZ的使用能够影响细胞自噬的发生,从而逃避死亡,细胞成功逃避死亡是TMZ耐药的又一影响因素。因此,影响GBM的死亡方式也是导致其对TMZ耐药的一个重要方式,进一步了解TMZ如何影响GBM死亡以及TMZ耐药后死亡方式的变化对深刻理解GBM的TMZ耐药过程和机制有重大意义。本论文首先通过药物浓度递增法构建TMZ耐药U87细胞株(U87-TR);随后,基于CtIP和PAXX在DNA修复过程中的重要作用,利用CRISPR/Cas9技术分别敲除了CtIP和PAXX;通过分析蛋白表达、细胞生长、克隆形成和裸鼠成瘤实验,探讨CtIP和PAXX在逆转TMZ耐药中的作用;并进一步研究CtIP和PAXX在TMZ耐药性中的分子机制,包括蛋白相互作用、同源重组(HR)、非同源末端连接(NHEJ)和碱基切除修复(BER)。结果显示,在U87-TR细胞中,CtIP和PAXX的蛋白表达显著高于野生型U87(U87-WT)细胞,并且TMZ可诱导U87-WT细胞中CtIP和PAXX的表达上调;在CtIP敲除(CtIP-/-)U87细胞中,NHEJ效率显著降低;而在PAXX敲除(PAXX-/-)U87细胞中,BER效率显著降低,铁死亡增加。铁死亡在肿瘤的发生和治疗中起到关键作用,特别是近年来在肿瘤耐药机制中的作用逐渐受到关注,这些实验结果,暗示我们CtIP和PAXX在耐药性机制中扮演重要角色。进一步研究,揭示了CtIP与DNA Ligase IV以及PAXX与DNA polβ之间的相互作用;细胞生长实验表明,抑制CtIP和PAXX表达可以逆转脑胶质瘤细胞的TMZ耐药性。本研究旨在探索GBM中TMZ耐药性的分子作用机制及潜在靶点,发现了GBM中TMZ耐药性的关键调控蛋白CtIP和PAXX,阐明了GBM中TMZ耐药性的分子机制,为GBM的治疗提供了新的潜在靶点,有望增强TMZ的疗效并逆转耐药性,为改善GBM患者的预后提供新的方法和选择。今后的研究将继续深入探讨CtIP、PAXX和SLC7A11在GBM中的异常表达对诊断和治疗的潜在价值,以及铁死亡在GBM耐药性中的具体作用和调控机制。