目的:1.研究IQGAP1(IQ motif containing GTPase activating protein)在食管鳞癌组织中的表达及与预后的关系;2.研究IQGAP1对紫杉醇耐药的影响;3.研究IQGAP1对食管鳞癌细胞铁死亡的影响;4.研究IQGAP1通过调控食管鳞癌细胞铁死亡影响紫杉醇耐药;5.研究IQGAP1通过靶向YAP1(Yes-associated protein 1)调控铁死亡影响紫杉醇耐药的机制。方法:1.生信及临床样本分析IQGAP1的表达与预后的关系(1)使用TIMER(tumor immune estimation resource)数据库分析IQGAP1基因在泛癌中的表达;通过Xena网站下载TCGA(the cancer genome atlas)数据,分析IQGAP1在食管癌及癌旁正常组织中的差异表达,并绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评估IQGAP1区分食管癌与癌旁正常组织的能力。(2)收集临床100例食管鳞癌患者的癌组织,69例癌旁正常组织及其临床相关病理特征信息,通过免疫组化检测IQGAP1蛋白在癌和癌旁正常组织中的表达差异;绘制ROC曲线评估IQGAP1区分食管鳞癌与癌旁正常组织的能力;并分析其表达水平与临床病理特征的关系;进一步根据生存数据绘制K-M(Kaplan-Meier)生存曲线和森林图,通过COX回归分析IQGAP1表达与预后的关系。2.IQGAP1对紫杉醇诱导的食管鳞癌细胞存活和死亡的影响(1)通过将GFP-IQGAP1质粒和对照组空载质粒稳定转染到EC9706细胞中构建IQGAP1高表达细胞系,IQGAP1短发夹RNA(small hairpin RNA,sh RNA)质粒和阴性对照组空载质粒Dolutegravir临床试验稳定转染到KYSE150细胞中构建IQGAP1基因干扰细胞系,并采用Western blot实验鉴定IQGAP1的表达水平。(2)采用不同浓度的紫杉醇分别处理IQGAP1高表达和对照细胞,以及基因干扰细胞和对照细胞,MTT实验检测食管鳞癌细胞活力;克隆形成及碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色实验分别检测食管鳞癌细胞增殖和死亡情况。3.IQGAP1对食管鳞癌细胞铁死亡的影响使用GSEA(gene set enrichment analysis)软件分析食管鳞癌中IQGAP1基因的富集通路;通过二氢乙锭(dihydroethidium,DHE)染色检测IQGAP1高表达或基因干扰对食管鳞癌细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响;通过丙二醛(malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)试剂盒分别检测IQGAP1对食管鳞癌细胞MDA和GSH水平的影响;通过Western blot实验检测IQGAP1对食管鳞癌细胞铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶质载体家族7成员Laboratory Centrifuges11(recombinant solute carrier family 7,member 11,SLC7A11)表达水平的影响。4.IQGAP1通过调控食管鳞癌细胞铁死亡影响紫杉醇耐药的研究采用铁死亡诱导剂(RSL3)或铁死亡抑制剂(ferrostain-1,Fer-1)作用于紫杉醇诱导的IQGAP1高表达或基因干扰细胞系,并通过上述方法分别检测食管鳞癌细胞存活、增殖和死亡情况,以及ROS、MDA、GSH水平和铁死亡相关蛋白的表达水平。5.IQGAP1通过靶向YAP1调节铁死亡影响紫杉醇耐药的机制首先通过Western blot检测IQGAP1高表达或基因干扰对食管鳞癌细胞YAP1表达的影响,TIMER数据库分析IQGAP1与YAP1在食管癌中的表达相关性;随后采用YAP抑制剂(Verteporfin,VP)作用于IQGAP1高表达细胞系,通过Western blot实验检测VP对紫杉醇干预的IQGAP1高表达食管鳞癌细胞中YAP1表达的影响;并通过上述方法分别检测食管鳞癌细胞存活、增殖和死亡情况,以及ROS、MDA、GSH水平和铁死亡相关蛋白的表达水平。结果:1.生信及临床样本分析IQGAP1的表达与预后的关系(1)TIMER数据库分析显示,IQGAP1在胆管癌(cholangiocarcinoma,CHOL),结肠癌(colon adenocarcinoma,COAD),食管癌(esophageal carcinoma,ESCA),头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC),胃癌(stomach adenocarcinoma,STAD),甲状腺癌(thyroid carcinoma,THCA)中的表达明显高于正常组织;TCGA数据分析进一步证明IQGAP1在食管癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,ROC曲线结果表明IQGAP1可以作为区分食管癌与癌旁正常组织的生物标志物。(2)免疫组化结果显示,IQGAP1在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,ROC曲线结果表明IQGAP1可以作为区分食管鳞癌与癌旁正常组织的生物标志物,临床数据分析表明食管鳞癌组织中IQGAP1表达与N期存在相关性,并与患者的五年总生存率(overall survival,OS)有关,是食管鳞癌患者OS的一个不良预后因子。2.IQGAP1对紫杉醇诱导的食管鳞癌细胞存活和死亡的影响(1)Western blot实验结果显示,IQGAP1高表达细胞系能表达GFP-IQGAP1融合蛋白,而对照组无;IQGAP1基因干扰细胞系的IQGAP1表达水平明显低于对照组细胞。提示成功建立IQGAP1高表达和基因干扰细胞系。(2)不同浓度的紫杉醇处理后发现,IQGAP1高表达细胞的存活率、增殖能力明显高于对照组细胞,细胞死亡数量明显低于对照细胞;而IQGAP1基因干扰细胞的存活率、增殖能力明显低于对照细胞,细胞死亡数量明显高于对照细胞。3.IQGAP1对食管鳞癌细胞铁死亡的影响GSEA富集分析显示,IQGAP1低表达组富集在线粒体的电子传递链(the electron transport chain,ETC)和氧化磷酸化相关通路,IQGAP1高表达组富集在糖酵解和缺氧相关通路;IQGAP1高表达细胞的ROS、MDA水平明显低于对照细胞,GSH水平、GPX4、SLC7A11表达明显高于对照细胞;而IQGAP1基因干扰细胞的ROS、MDA水平明显高于对照细胞,GSH水平、GPX4、SLC7A11表达水平明显低于对照细胞。4.IQGAP1通过调控食管鳞癌细胞铁死亡影响紫杉醇耐药的研究采用RSL3或Fer-1和紫杉醇联合作用于IQGAP1高表达或基因干扰细胞系,结果显示,RSL3可以逆转IQGAP1高表达对紫杉醇诱导的食管鳞癌细胞增殖,死亡,ROS、MDA、GSH水平和GPX4、SLC7A11表达水平的影响;Fer-1可以逆转IQGAP1干扰对紫杉醇诱导的食管鳞癌细胞增殖,死亡,ROS、MDA、GSH水平和GPX4、SLC7A11表达水平的影响。5.IQGAP1通过靶向YAP1调节铁死亡影响紫杉醇耐药的机制Western blot实验结果显示,IQGAP1高表达上调YAP1的表达,IQGAP1基因干扰下调YAP1的表达;TIMER数据库分析表明在食管癌组织中IQGAP1和YAP1的表达呈正相关;采用VP和紫杉醇联合作用于IQGAP1高表达细胞系,通过Western blot实验结果表明,与对照组相比,YAP1的表达下调;VP可以逆转IQGAP1高表达对紫杉醇干预的食管鳞癌细胞增殖、死亡,ROS、MDA、GSH水平和GPX4、SLC7A11表达水平的影响。结论1.IQGAP1在食管鳞癌组织中高表达,并与食管鳞癌患者的不良预后相关。2.IQGAP1高表达能够降低食管鳞癌细胞对紫杉醇的敏感性,IQGAP1基因干扰能够增强食管鳞癌细胞对紫杉醇的敏感性。3.IQGAP1高表达能够抑制食管鳞癌细胞发生铁死亡,IQGAP1基因干扰能够促进食管鳞癌细胞发生铁死亡。4.IQImmunology & Inflammation抑制剂GAP1高表达通过抑制铁死亡导致食管鳞癌细胞对紫杉醇耐药,靶向干扰IQGAP1能通过促进铁死亡增强食管鳞癌细胞对紫杉醇的敏感性。5.IQGAP1通过靶向YAP1分子调控铁死亡影响紫杉醇化疗耐药。