硒(Selenium,Se)是一种对机体健康非常重要的必需微量元素,参与免疫系统、消化系统、呼吸系统、泌尿系统、内分泌系统、生殖系统和心血管系统等功能的调控。硒缺乏会诱发多种组织和细胞的损伤,包括脑、胰腺、乳腺、肝脏、动脉和肠道组织等。双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种环境内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs),常用于化工产品和食品包装材料中,这些材料的降解会使BPA释放到环境中并干扰人类或动物的内分泌系统从而对机体造成诸多损害。同时,大量研究表明,心血管系统也是BPA和缺硒靶向的目标之一。BPA暴露和硒缺乏能够诱发氧化应激,且有研究证明BPA暴露和硒缺乏通过降低机体的抗氧化能力引起动脉血管内皮细胞凋亡,从而对动脉造成损伤。Mi RNAs是一类内源性的短链非编码RNA,可以特异性调节其靶m RNA调控一系列生物学反应。越来越多的研究揭示了miRNA是一系列病理生理细胞效应和分子信号通路的重要调节因子。但是目前关于BPA暴露和硒缺乏对肉鸡动脉组织的损伤机制以及miRNA是否通过ROS/PI3K/AKT信号通路参与动脉损伤尚不清楚。为了深入探讨BPA暴露和硒缺乏介导的miRNA对调节肉鸡动脉内皮细胞凋亡的作用机制,本试验采用了BPA暴露/硒缺乏在鸡动脉和鸡动脉内皮细胞(Pulmonary artery endothelial cells,PAEC)的模型,还在体外建立了miR-215-3p和Dio1的敲低/过表达模型。即体内试验分为四组,对照组(C组)、硒缺乏组(-Se组)、BPA暴露组(BPA组)、硒缺乏+BPA暴露组(-Se+BPA组)。体外试验分为四组(C组、-Se组、BPA组、-Se+BPA组)和五组(C组、-Se+BPA组、-Se+BPA+Inhibitor组、-Se+BPA+NAC组、-Se+BPA+LY294002组)。通过q RT-PCR对鸡动脉组织中25种硒蛋白检测发现了差异表达显著的Dio1,通过生物信息学靶向预测网站预测了靶向Dio1的miRNAs,并使用双荧光素酶基因报告分析、q RT-PCR和western blot等方法分析并验证了miR-215-3p与Dio1之间的靶向关系。采用H&E染色观察鸡动脉组织的形态学变化,利用透射电镜、TUNEL检测、流式细胞术、AO/EB染色和免疫荧光观察caspase-3的表达评估鸡动脉内皮细胞的凋亡信号,采用实时荧光定量PCR、western blot等技术检测鸡动脉组织和PAEC细胞中PI3K/AKT通路、线粒体动力学基因(Drp1、Mfn1、Mfn2、OPA1)和线粒体凋亡途径相关基因(Bcl-2、Bax、cytc、APAF-1、caspase-9、caspase-3)的表达。此外,本试验还对不同组的鸡动脉组织和PAEC细胞中CAT、GSH、GPX、SOD、MDA、e NOS、i NOS、ATP酶和ATP的含量或活性进行了测定NN2211溶解度,对不同组PAEC细胞进行了ROS染色。研究结果如下:(1)病理组织学观察发现BPA暴露和硒缺乏导致动脉组织胶原纤维增生、内膜斑块隆起、瘢痕组织增生、弹性纤维断裂等损伤。超微结构观察发现BPA暴露和硒缺乏导致动脉血管内皮细胞呈现核固缩、染色质聚集及边聚化等明显的细胞凋亡特征。动脉组织的TUNEL染色和免疫荧光染色结果表明,BPA暴露和硒缺乏组鸡动脉内皮细胞凋亡阳性细胞数显著增加,细胞凋亡关键因子caspase-3的表达显著增加,BPA暴露和硒缺乏联合作用下的细胞凋亡尤为明显。这说明BPA暴露和硒缺乏诱导动脉血管内皮细胞凋亡,且呈现BPA暴露加重硒缺乏诱导的细胞凋亡的趋势。(2)BPA暴露和硒缺乏条件下肉鸡动脉组织中抗氧化酶CAT、GSH、GPX、SOD的活性降低,MDA水平升高,PAEC细胞中ROS释放明显增多。BPA暴露和硒缺乏条件下动脉组织中e NOS酶活性降低,i NOS酶活性升高。结果说明BPA暴露和硒缺乏会导致动脉组织抗氧化能力减弱。(3)BPA暴露和硒缺乏条件下动脉组织和PAMK-1775 IC50EC细胞中线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2、OPA1的蛋白和m RNA水平显著降低,线粒体分裂蛋白Drp1的蛋白和m RNA水平显著升高。BPA暴露和硒缺乏导致ATP酶活性和ATP水平显著降低。这些结果表明,BPA暴露和硒缺乏可能通过增强线粒体分裂和抑制线粒体ATP的合成促进细胞凋亡。(4)通过AO/EB、流式细胞术、western blot和q RT-PCR检测发现,BPA暴露和硒缺乏条件下PI3K/AKT通路基因明显被抑制,细胞凋亡信号明显增强,线粒体凋亡途径相关因子cytc、APAF-1、Bax、caspase-9、caspase-3的表达明显增强,并且数据显示BPA暴露和硒缺乏联合作用下的细胞凋亡尤为明显。说明BPA暴露和硒缺乏可能通过抑制PI3K/AKT通路诱导细胞凋亡,且呈现BPA加重硒缺乏条件下的细胞凋亡的趋势。(5)在筛选得到Dio1为BPA暴露和硒缺乏条件下的差异表达显著的硒蛋白后,通过Targetscan,miRDB等网站预测得到特异性靶向Dio1的miR-215-3p。在PAEC细胞中成功构建了miR-215-3p/Dio1的敲低/过表达模型,通过双荧光素酶基因报告分析、q RT-PCR和western blot验证了miR-215-3p与Dio1之间的靶向关系。(6)在PAEC细胞中miR-215-3p过表达和Dio1表达降低时,ROS的释放明显增多,PI3K/AKT通路基因明显被抑制,线粒体分裂蛋白表达显著升高,线粒体融合蛋白表达显著降低,ATP酶活性和ATP水平显著降低,细胞凋亡信号明显增强,线粒体凋亡途径相关基因表达明显增强。除此之外,miR-215-3p-Inhibitor和NAC阻断了由BPA暴露和硒缺乏引起的细胞凋亡,LY294002加重了细胞凋亡。这些结果说明,BPA暴露通过调控miR-215-3p/immune pathwaysDio1激活ROS/PI3K/AKT途径加重鸡缺硒性动脉内皮细胞凋亡。综上所述,BPA暴露和硒缺乏可以导致肉鸡动脉组织发生明显损伤。BPA暴露和硒缺乏引起miR-215-3p过表达,抑制Dio1的表达,产生过量的ROS抑制PI3K/AKT通路,促进线粒体分裂,通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。本研究阐明了BPA暴露调控miR-215-3p/Dio1轴激活ROS/PI3K/AKT信号通路加重鸡缺硒性动脉内皮细胞凋亡。